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Research Article

Horticultural Science and Technology. 28 February 2023. 100-110
https://doi.org/10.7235/HORT.20230010

Transcriptome Analysis of Pepper-Phytophthora infestans Interaction Based on a Pipeline of a Simplified and Effective RNA-seq Analysis (PoRAS)

PoRAS 파이프라인 구축 기반 고추-감자역병균 상호작용 전사체 분석
Junesung Lee1†
,
Hagki Jang2†
,
Won-Hee Kang12
,
Seon-In Yeom12*
이 준성1†
,
장 학기2†
,
강 원희12
,
염 선인12*
1Division of Applied Life Science (BK21 Four), Gyeongsang National University, Jinju 52828, Korea
2Department of Horticulture, Institute of Agriculture & Life Science, College of Agriculture and Life Sciences, Gyeongsang National University, Jinju 52828, Korea
1경상국립대학교 응용생명과학부(BK21 four)
2경상국립대학교 원예과학부, 농업생명과학연구원
*Corresponding Author
†These authors contributed equally to this work.

ABSTRACT

Crop productivity is threatened by a variety of pathogens. As a mean by which to solve this problem, research to identify resistance mechanisms and key factors through the use of plant-disease interaction transcripts is being actively conducted. The discovery of key factors through the next-generation sequencing (NGS) technique has been used in various studies, but the use of an optimized and simplified analysis pipeline is limited due to its complex and diverse programs. In this study, we present a pipeline of a simplified and effective RNA-seq analysis (PoRAS) for a transcriptome core analysis, with RNA-seq data of pepper-phytophthora infestans interaction global gene profiling, differential gene expression (DEG), and a gene set enrichment analysis (GSEA) then performed to validate the PoRAS. Data preprocessing and quality checks were conducted for a total of 39 transcripts using the established transcriptome analysis pipeline, and it was confirmed that 84.87–92.38% of high-quality sequences remained in each dataset. Subsequently, 2,594 DEGs were obtained through a DEG analysis, and the function of the gene cluster was confirmed through a GSEA. This led to the confirmation that the functions of the defense response, response to a biological stimulus, and the recognition of pollen appeared most significantly. These results suggest that PoRAS can be a useful tool for basic and core analyses to find and identify key genetic factors from a large amount of RNA-seq data. Through this, the analysis pipeline presented in this study, PoRAS, is deemed feasible as a strategy to secure key genetic factors if used to conduct basic to core analysis stages targeting a large amount of RNA-seq information.

Keywords
Capsicum annuum
data analysis
DEG
gene expression profiling
methodology

작물 생산성은 다양한 병원균에 의해 크게 위협받고 있다. 이를 해결하기 위한 방법으로 식물-병 상호작용 전사체 활용을 통해 저항성 기작 및 핵심 인자 규명 연구가 활발히 진행되고 있다. NGS기법을 통한 핵심인자 발굴은 다양한 연구에서 사용되어지고 있지만 복잡하고 다양한 프로그램으로 인해 최적화된 분석 파이프라인은 알려지지 않았다. 본 연구에서는 고추-감자역병 상호작용 전사체를 기반으로 핵심 유전인자 선발을 위한 핵심분석을 위한 사용자 편의성 증대 분석 파이프라인(pipeline of simplified and effective RNA-seq analysis, PoRAS)을 제시하고 고추와 감자역병균 상호 반응 유전자 전체에 대한 프로파일링을 수행했다. 구축된 전사체 분석 파이프라인을 활용하여 총 39개의 전사체를 대상으로 데이터 preprocessing 및 quality check을 수행했고, 각 데이터에서 84.87–92.38%의 고품질 서열이 남은 것을 확인하였다. 이후 DEG 분석을 통해 2,594개의 DEG를 확보하였으며 이후 GSEA를 통한 유전자 군집의 기능을 확인하였다. 그 결과 defense response, response of biology stimulus 및 recognition of pollen 등의 기능이 가장 유의하게 나타난 것을 확인할 수 있었다. 이를 통해 본 연구에서 제시한 분석 파이프라인, PoRAS는 대량의 RNA-seq 정보를 대상으로 기본에서 핵심 분석 단계를 통해 유의미한 정보를 확보할 수 있으며 이는 전사체 분석을 통한 핵심 유전인자의 확보를 위한 전략으로 사용될 수 있다.

키워드
Capsicum annuum
데이터 분석
차등발현 유전자
유전자 발현 프로파일링
방법론

MAIN

  • 서 언

  • 재료 및 방법

  •   분석 데이터 수집 및 전처리

  •   Read mapping 및 정량화

  •   차등발현 유전자 선발

  •   Gene set enrichment analysis (GSEA)

  •   PoRAS 기반 전사체 분석 파이프라인 구축

  • 결과 및 고찰

  •   PoRAS 파이프라인 구축

  •   고추-감자역병균 상호작용 RNA-seq 분석을 통한 Pre-analysis 검증

  •   유전자 발현 정량화 및 샘플 검증을 통한 Core-analysis 검증

  •   고추-감자역병균 유용 유전자 발굴

  •   고추-감자역병균 상호작용 핵심 기능 분석

서 언

병원균은 작물 생산량과 품질에 영향을 끼치는 주 요인 중 하나로써 전 세계적으로 작물의 약 30%이상이 병원균에 의해 손실된다고 알려져 있다(Chun et al., 2011). 인류는 병원균의 피해를 최소화하기 위하여 화학적 방제법을 주로 사용해왔지만, 지속적인 농약사용은 토양의 산성화 및 잔류독성, 환경오염 등의 문제를 일으켜 왔다(Bitew and Alemayehu, 2017). 이러한 문제에도 불구하고 현재까지도 병원균에 의한 피해를 방제하기 위해 화학적 방제를 사용하고 있으며 현재의 상황을 개선하기 위해서는 저항성 형질을 가진 유전자원을 활용한 병저항성 품종 육성을 통한 자연 친화적 방제가 중요하다(Martin, 2011; Kwon et al., 2021; Kang et al., 2022a).

감자역병은 Phytophthora infestans라는 난균류에 의해 발병되며, 매년 전 세계적으로 약 50억 달러에 이르는 피해를 입힌다고 알려져 있다(Tsedaley, 2014). 고추의 경우 고추-감자역병 상호작용 스크리닝 분석(Lee et al., 2014) 을 통해 감자, 토마토와는 달리 감자역병균에 대해 비기주 저항성을 가지고 있는 것으로 알려져 있다. 고추-감자역병 상호작용 전사체의 분석의 경우 특정 형질 및 한정된 유전자들을 대상으로 분석되었다(Lee et al., 2017). 따라서 비기주 저항성의 핵심 인자 동정을 위해 전체 유전자에 대한 프로파일링 및 유전자의 기능 연구가 추가적으로 필요하다. 최근에는 다양한 전략을 통해 기주 및 비기주 저항성 유전자를 발굴하고 이를 활용한 새로운 저항성 형질을 발굴하고 육종에 적용하고자 하는 연구가 진행되고 있다(Lee et al., 2016; Seo et al., 2016; Kim et al., 2017; Oh and Choi, 2022).

NGS(Next generation sequencing)기술이 발달함에 따라 유전체 및 전사체 분석 연구가 증가하는 추세이며 이를 통해 식물내 전체 유전자의 변이 및 발현정도를 확인하는 다양한 분석방법이 제안되고 있다. 이러한 분석방법은 인간, 동물, 미생물뿐만 아니라 식물에서도 생명현상을 이해하기위해 다양한 분석에 수행되고 있으며(Conesa et al., 2016; Kim et al., 2020; Lee et al., 2021), 특히 전사체 분석에 사용되고 있는 RNA-seq 방법의 경우 다양한 환경스트레스와 관련된 기작을 규명하기 위해 중요 작물들의 전체 유전자들에서 형질 반응 및 특이성을 가지는 유전자들을 선발함으로써 다양하고 복잡한 저항성 체계를 확인하는데 사용되고 있다(Wang et al., 2009; Lee et al., 2019; Kang et al., 2020). 하지만, RNA-seq을 이용한 전사체 분석은 다양한 분석 프로그램이 제시됨에 따라 다양한 조건을 고려해야 하며 획일화된 분석 방법은 확립되지 않았다(Dobin et al., 2013; Bolger et al., 2014; Fumagalli et al., 2014; Kim et al., 2015).

본 연구에서는 전사체 분석을 위한 기초 전략도를 제시하고 고품질 서열을 확보하여 감자역병균에 반응하는 고추 유전자 전체의 발현패턴을 확보하였다. 또한, 특이적으로 반응하는 고추 유전자 2,594개의 유전자를 선발하여 접종 후 시간대에 따라 반응하는 유전자의 Gene Ontology(GO)를 확인하여 defense response(GO: 0006952)와 같은 저항성 관련 유전자 군집의 반응을 확인하였다. 본 연구를 통해 감자역병균에 반응하는 전체 고추 유전자의 반응성을 확인하였고, 그에 따라 제시된 전략을 통해 RNA-seq 데이터를 기반으로 한 분석을 통해 핵심 후보 인자를 선발에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하였다.

재료 및 방법

분석 데이터 수집 및 전처리

본 연구는 고추(Capsicum annuum ‘CM334’)의 잎에 감자역병균을 처리하여 각 7개의 시간대(0h, 6h, 12h, 1D, 2D, 3.5D, 5D)의 반응을 확인하기 위한 RNA-seq 데이터를 사용하였다. 해당 데이터는 NCBI의 Sequence Read Archive database에 공개된 SRP106410(Kim et al., 2018) 데이터를 이용하여 수행하였다. 각 처리는 3반복으로 샘플링 되었으며 Hiseq 2500을 통해 sequencing되었다.

전체 RNA-seq 데이터에서 어댑터 서열 및 부정확한 서열의 제거는 각각 Cutadapt(Martin, 2011) 와 Trimmomatic(Bolger et al., 2014) 프로그램을 이용하여 수행하였다. Filtering의 기준은 Phred score < 20을 기준으로 제거하였으며 추가로 단일 서열의 길이가 36bp이하인 서열은 제거하였다(Lee et al., 2020; Kim et al., 2021). 이후 각 sequencing 데이터의 검증을 위해 FastQC(Andrews, 2010) 와 MultiQC(Ewels et al., 2016) 프로그램으로 데이터의 품질을 확인하였다.

Read mapping 및 정량화

전처리를 통해 확보한 clean reads는 HiSat2(Kim et al., 2015) 프로그램을 통해 고추 유전자(Annuum.v.2.0.CDS.fa)에 mapping시켰다. Mapping에 사용한 고추 유전자 정보는 “Pepper Genome Database”(http://peppergenome.snu.ac.kr/)에서 확보하였다. 고추 유전자 서열에 정렬된 read는 FPKM(fragments per kilobase of transcript per million)으로 발현 값을 보정하였으며(Ding et al., 2015) in-house script를 통해 계산하였다. 유전자의 발현을 통해 sample간 차이를 검증하기 위해 주성분분석(principle component analysis, PCA) 및 sample clustering분석을 수행하였고, 각 분석 및 시각화는 R studio프로그램을 통해 수행되었다.

차등발현 유전자 선발

정량화를 통해 확보한 유전자의 발현을 기반으로 대조군과 실험군의 차이를 확인하기 위해 DESeq2 bioconductor package(Love et al., 2014)를 통해 분석을 수행했다. 각 시간대(6h, 12h, 1D, 2D, 3.5D, 5D)에 따라 control(TDW 접종) 대비 발현이 4배 이상(Log2FC > |2|) 차이를 보이고 FDR값이 0.05이하인 유전자를 기준으로 DEG(differentially expressed gene)를 선발하였다. 각 DEG에 따른 발현의 시각화는 R studio프로그램을 통해 수행되었다. boxplot과 heatmap은 R studio의 boxplot함수와 ComplexHeatmap R 패키지를 사용했다(Kang et al., 2018; Kim et al., 2019; Kang et al., 2021).

Gene set enrichment analysis (GSEA)

앞선 분석을 통해 선발된 DEG를 기반으로 각 시간대에 따라 반응하는 유전자들의 기능을 확인하기 위해 GSEA 분석 중 GO 분석을 수행하였다. GO는 R 패키지의 goseq(Young et al., 2012)을 통해 분석을 수행하였으며 FDR < 0.05를 기준으로 filtering 하였다. 전체 GO 결과 중 유전자 군집의 기능을 확인하기 위해 Biological Process(BP)를 중심으로 분석을 수행하였다.

PoRAS 기반 전사체 분석 파이프라인 구축

전사체 분석을 위한 PoRAS 플랫폼은 아래와 같이 2단계로 나누어 각 분석 단계별 세부 파이프라인 생물정보 분석 코드 및 필요 프로그램은 github(https://github.com/Lee-June-Sung/PoRAS)에서 사용 가능하도록 구축하였다. 1단계는 sequencing 이후 불필요한 정보 및 정확한 결과의 확보를 위한 filtering 과정이며 preprocessing 및 QC단계가 포함되어 있다. 각 단계는 Cutadapt, Trimmomatic, FastQC 그리고 MultiQC를 통해 분석을 수행한다. 2단계는 전처리 이후 모든 분석 과정이 포함되며 핵심 유전자의 선발을 위해 구축되었다. 각 단계는 Hisat2, DESeq2 그리고 GOseq 프로그램이 활용되며, R 과 perl 코드를 기반으로 데이터 분석 및 검증을 을 수행하였다.

결과 및 고찰

PoRAS 파이프라인 구축

RNA-seq 분석은 크게 Pre-analysis, Core-analysis 및 Advanced-analysis로 분류하여 분석을 수행하며 이는 대부분의 연구에서 공통적으로 적용되고 있다(Conesa et al., 2016). 본 연구에서는 Pre-analysis와 Core-analysis의 일부 분석을 위한 파이프라인을 구축하여 샘플에 대한 모든 유전자의 발현패턴을 확인하고 핵심 유전인자의 발굴을 위한 분석을 수행하는 기초 파이프라인을 구축하였다(Fig. 1). 먼저 Pre-analysis에 해당하는 Pre-processing 단계에서는 raw data의 품질 향상을 위해 전처리 과정을 수행한다. 이 때, Cutadapt를 통해 sequencing 과정에서 생성되는 adaptor 서열을 제거하여 임의로 생성된 서열을 제거한다. 이후 Trimmomatic을 통한 sequencing 서열 정확도 보정을 수행하여 개별 read에서 정확도가 떨어지는 서열을 제거함으로써 sequencing 과정에서 생성되는 에러를 최소화한다. 이 두 과정을 통해 생성된 RNA-seq data는 adaptor 서열이 없는 고품질 데이터로 이후 core-analysis 단계에서 에러를 최소화하여 정확한 정보를 확보할 수 있다.

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Fig. 1.

Strategy for PoRAS. The main analysis steps are carried out in a total of five steps; detailed descriptions are listed in the M&M section.

Core-analysis에 해당하는 Read mapping ~ Functional enrichment 과정은 전처리 이후의 고품질 데이터를 기반으로 유전자 전체에 대한 발현패턴을 확보하고 핵심 유전인자를 선발하는 과정이다. 먼저 HiSat2를 이용한 Read mapping을 통해 유전자 서열과 유사한 read를 정렬한다. 이후 mapping 결과를 수치화하여 유전자들에 대한 발현을 확인하며 본 연구에서는 FPKM으로 유전자들의 발현을 정량화하였다. 이를 통해 각각의 유전자에 대한 발현을 확인할 수 있지만 효과적으로 비교하기 위해 통계적으로 유의한 차이를 나타내는 유전자들을 선발하는 과정을 거친다. 해당 과정은 DESeq2를 통해 유전자의 발현을 비교하며 본 과정을 통해 대조구(여기서부터 TDW)과 감자역병균 접종 처리구(여기서부터 Pi)간의 발현차이가 유의하게 나타나는 유전자만을 선발할 수 있다. 유전자의 기능이 할당된 reference genome의 경우에는 확보한 DEG의 기능을 보다 쉽게 확인하여 핵심 유전인자를 확인할 수 있지만 기능에 대한 유전자 군집의 확인하기 어려운 유전체의 경우에는 Functional enrichment와 같은 기능분석을 통해 핵심인자를 선발한다. 본 파이프라인에서는 gene ontology term(GO term)을 통해 DEG의 기능을 확인할 수 있도록 구축하였으며 유의성 기준을 통과한 GO term을 통해 유전자 군집의 기능을 유추하여 핵심 인자를 선발할 수 있다.

각 단계별 분석을 수행할 때 오류를 최소화 하기위해 각 단계별 Quality check(QC) 과정을 추가하여 정확도를 보정하였다. Pre-analysis 과정에서 확보되는 fastq 파일의 점검을 위해 FastQC와 MultiQC를 통해 각 데이터의 sequencing error와 정확도를 확인하여 정상적인 데이터를 선별할 수 있다. 이후 유전자의 발현을 수치화한 후 Principal component analysis(PCA)분석 및 sample clustering을 통해 데이터간 variation을 확인하여 동일 처리 샘플간 또는 Pi와 TDW간의 차이를 확인하여 데이터의 오염과 같은 데이터 생성간 발생할 수 있는 오류를 줄일 수 있도록 구축하였다. 마지막으로 DEG 분석 및 Functional enrichment 과정을 통해 각 데이터가 유추가능한 유전자의 반응성을 확인함으로써 Pi 처리가 정상적으로 수행되었는지 점검 가능하도록 설계하여 각 분석과정 및 결과의 신뢰도와 정확도를 높일 수 있는 파이프라인을 구축하였다.

고추-감자역병균 상호작용 RNA-seq 분석을 통한 Pre-analysis 검증

파이프라인의 검증을 위해 고추-감자역병균 상호작용 RNA-seq 데이터를 사용하였다. 데이터는 최소 raw read가 8,671,868 최다 raw read는 17,324,392로 확인하였다(Table 1 and Suppl. Table 1). 이후 전처리 과정을 수행하였고, 어댑터 서열 및 저품질 서열을 제거함으로써 전체 데이터에서 고품질의 정보만을 확보하였다. 이를 통해 확인된 clean read는 최소 8,005,004 최다 15,757,564로 확인되었으며 84.86–92.37%의 고품질 서열이 남은 것을 확인하였다(Table 1 and Suppl. Table 1). 이후 해당 서열들의 품질을 세부적으로 확인하고자 FastQC 및 MultiQC 프로그램을 통해 전사체 데이터들의 품질을 확인하였다. 전체 샘플에서 위치에 따른 reads들의 서열 위치 기반 quality score를 확인한 결과 read들의 평균 품질은 quality score가 30 이상(base call 정확도 > 99.9%)이 되는 것을 확인하였다(Fig. 2A). 또한, 39개의 모든 샘플들의 샘플 내 전체 서열의 개수기반 quality score를 확인한 결과 모든 샘플에서 20 이상(base call 정확도 > 99%)이 되는 것을 확인하였다(Fig. 2B). 전처리를 통해 확보한 clean read는 raw data 대비 평균 9.36%가 filtering 되었으며(Fig. 2C), 2.0버전의 고추 CDS에 mapping된 비율은 평균 65.52%로 동일 참조유전자서열을 사용한 다른 선행논문(Zhang et al., 2016)의 mapping 비율(53.78–56.38%)보다 더 높은 수치를 보였다. 따라서 본 연구에서 제시한 전처리 방법에 따른 quality control에는 이상이 없는 것으로 확인되었으며 본 분석을 통해 생성된 clean read를 이용하여 이후 Core-analysis에 사용하였다.

Table 1.

Summary Statistics of Pepper-P. infestans Interacted with RNA-seq for the PoRAS-based Transcriptome Analysis

Samplez Raw reads Clean reads Filtered ratio (%) Mapped reads Mapping ratio (%)
CM-pi-0 12,497,044 11,481,985 91.88 7,558,895 65.79
CM-TDW-6h 14,159,873 12,567,949 88.57 8,515,183 67.75
CM-TDW-12h 14,211,393 12,984,145 91.41 8,674,523 66.84
CM-TDW-1D 10,622,809 9,213,476 86.81 6,025,402 65.35
CM-TDW-2D 12,524,443 11,308,969 90.33 7,273,575 64.40
CM-TDW-3.5D 10,755,521 9,618,353 89.45 5,974,739 62.00
CM-TDW-5D 11,534,617 10,177,878 88.12 6,503,032 63.92
CM-pi-6h 12,016,665 11,045,365 91.90 7,446,744 67.38
CM-pi-12h 12,645,779 11,615,109 91.86 7,718,453 66.41
CM-pi-1D 11,050,668 10,138,304 91.84 6,723,946 66.32
CM-pi-2D 13,870,755 12,769,601 92.06 8,533,244 66.81
CM-pi-3.5D 13,544,129 12,445,278 91.89 7,967,957 64.10
CM-pi-5D 13,423,639 12,365,602 92.13 7,984,655 64.63

zAll samples were from accession number SRP106410 in the NCBI database.

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Fig. 2.

Quality assessment of pepper transcriptomes. The filtered reads from all 39 samples were assessed by MultiQC. (A) Mean quality score distribution in each position, (B) Read counts distribution for the mean sequence quality, (C) Filtering and read mapping ratio, (D) The distribution of normalized FPKM for 34,899 pepper gene expressions measured in each sample was confirmed. Data were converted to log2 to prevent values from shifting to one side and to reduce deviations between expression values.

유전자 발현 정량화 및 샘플 검증을 통한 Core-analysis 검증

앞선 과정에서 생성된 유전자의 read count는 샘플 간 유전자의 발현을 비교하기 위해 FPKM으로 정규화하였다. 샘플 내 전체 유전자 발현 값을 확인한 결과 최소 0에서부터 최대 68264.23(log2 FPKM = 16.05)까지 다양하게 분포한다는 것을 확인할 수 있었다(Fig. 2D). 이후 실험군의 각 sample 처리간 오류를 확인하기위해 전체 유전자의 발현패턴을 통해 PCA분석 및 sample clustering을 수행하였다. P. infestans 및 TDW를 접종한 고추 전사체의 시간대별 발현 값 변화를 확인하였고, 대부분의 처리에서 3반복간 동일한 그룹으로 분류되는 것을 확인하였다(Fig. 3). Sample clustering에서 TDW 1d와 TDW 2d 샘플을 제외한 모든 샘플에서 3반복 샘플이 같은 그룹으로 묶이는 것을 확인하였으며 이는 각 반복이 매우 유사한 유전자 발현 패턴을 나타내는 것을 의미한다(Fig. 3A). 또한 PCA분석을 통해 확인한 결과 Pi와 TDW 사이의 유전자들의 발현패턴이 확연히 두 그룹(붉은색-Pi; 회색-TDW)으로 구분되었으며 3반복간 매우 유사한지점에서 확인되는 것을 확인할 수 있다(Fig. 3B). 이는 두 처리가 명확히 다른 유전자 발현패턴을 나타내는 것을 의미하며 3반복의 처리가 정상적인 것을 의미한다. 이를 통해 본 과정을 통해 새로 생산한 데이터 및 오픈소스 데이터를 이용한 데이터에서 sample간 차이를 확인할 수 있으며 이를 통해 처리된 샘플의 특성을 확인하여 본 분석에서의 오류율을 최소화할 수 있다.

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Fig. 3.

Sample clustering and principal component analysis of samples with gene expression for validation in the PoRAS QC step. (A) Classification of RNA-seq samples through a hierarchical clustering analysis. Each color represents a certain time point and treatment group, (B) A principal component analysis (PCA) was conducted to determine the degree of variation of each sample, and samples were grouped according to each treatment (P. infestans, TDW). The red group was treated with P. infestans as a treatment and the gray group was treated with triple-distilled water (TDW) as a control.

고추-감자역병균 유용 유전자 발굴

특이적으로 발현된 유전자(DEG)의 선별은 TDW와 비교하여 P. infestans를 접종했을 때 발현 값이 4배 이상 차이가 나는(log2 FC > |2|) 유전자들을 각 시간대(6h, 12h, 1D, 2D, 3.5D, 5D)별로 추출하였다. 그 결과 선발된 2,594개의 DEG에 대한 발현차이를 확인하기 위해 log2 FPKM값을 기반으로 발현패턴을 확인하였다(Fig. 4). 먼저 각 시간대별 비교를 위해 발현 변화를 중심으로 패턴을 확인하였으며 1d에서 DEG가 605개로 가장 적게 나타났으며 3.5d에서 유전자가 1,552개로 가장 많이 변화하는 것을 확인하였다(Fig. 4A). 또한 모든 시간대에서 up-regulation되는 유전자가 down-regulation되는 유전자보다 더 많이 확인된 것을 통해 Pi가 처리됨에 따라 발현이 억제되는 유전자보다 더 강하게 발현이 유도되는 유전자가 많은 것을 의미하며 발현이 변화한 유전자들은 TDW 보다 4배이상 강하게 또는 약하게 발현되는 것으로 식물의 발현변화가 매우 강하게 일어나는 것을 알 수 있다. 이러한 유전자의 발현을 heatmap을 통해 패턴을 확인할 수 있는데 이를 통해 두 샘플간 유전자의 발현변화의 시간대 별 차이를 확인할 수 있다(Fig. 4B). 해당 결과에서 발현된 DEG들은 대부분 TDW대비 Pi처리에서 발현이 강하게 유지되었으며, 이 방법을 통해 확인된 DEG는 선행연구에서 비기주저항성을 유도한다고 제시되었던 CA12g05030(CA.PGAv.1.6.scaffold459.13와 베스트 매치) 와 CA12g05140(CA.PGAv.1.6.scaffold135.6와 베스트 매치)등의 핵심 저항성 유전자들을 포함하고 있다(Suppl. Table 3; Lee et al., 2017). 이를 통해 본 분석방법을 통한 유전자의 발현패턴 확인 및 후보 유전자 선발에 유용하게 사용할 수 있음을 확인하였다.

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Fig. 4.

Differentially expressed genes by P. infestans inoculation belonging to the core-analysis stage of PoRAS. (A) Scatter plot based on gene expression changes, and (B) corresponding heatmap. Differential expression genes were selected based on genes expressed two times more or less than the control. The FPKM values and expression change value (log2 FC and -log FDR) for 2,594 genes differentially expressed at all times (6h, 12h, 1D, 2D, 3.5D, and 5D) were log2 transformed and then expressed as heatmaps.

고추-감자역병균 상호작용 핵심 기능 분석

각 시간대에 따른 DEG를 중심으로 유전자군집을 설정하여 GSEA 분석을 통해 유전자 군집의 기능을 확인하였다(Fig. 5). 각 시간대별로 확인된 유전자 군집의 기능은 대부분 유사한 기능을 나타냈고, 공통적으로 defense response에 가장 많은 유전자들의 기능이 확인되었다(Suppl. Table 2). defense response에 해당하는 유전자는 방어반응의 조절인자(GO:0031347; Defensive response regulation), 타 종에 의한 방어기작(GO:0098542; defense response to other organism), 방어반응 부정적인 규제(GO:0031348; negative regulation of defense response) 등의 기능을 가진 유전자들을 포함하고 있고, 병원균에 대한 저항성 반응을 포함한 다양한 외부 환경스트레스 상호작용에서 방어기작 혹은 관련 신호전달에 관여한다고 보고되었다(Lee and Yeom, 2015; Kang et al., 2022b). 이들 GO term을 가진 유전자들은 Pi에 대한 외부 환경 스트레스들에 대한 저항성 반응을 나타내는 핵심 인자로써 기능을 할 것으로 해석할 수 있다. 또한 response of biology stimulus(GO:0050896) 및 recognition of pollen(GO:0048544)이 가장 유의한 차이를 보였다. 해당 결과 중 recognition of pollen(GO:0048544)의 경우에는 시간대가 후기로 넘어갈수록 TDW에 비해 유의성이 높아진다. 이들 그룹에는 자가면역(autoimmunity) 및 신호전달 반응에 관여하는 RLP/RLK를 포함한 리간드 인지 단백질들이 대표적으로 포함된다(Sanabria et al., 2010; Kang and Yeom, 2018; Wan et al., 2021). 특이적으로 2d 와 3.5d에서는 photosynthesis(GO:0015979) 가 가장 유의하게 나타났으며 이 그룹들의 유전자들은 식물 호르몬 반응 조절 및 이를 통해 다양한 스트레스 반응 신호전달에 관여하는 것으로 보고되었다(Attaran et al., 2014; Kang et al., 2020). 이러한 결과를 통해, 감자역병균과의 상호작용 동안 외부 자극에 반응하는 인지 단백질군과 신호전달 관련 유전자군들의 상호작용을 통해 고추에서 감자역병균 대한 비기주 저항성 반응에 관여하는 것으로 예측된다(Lee et al., 2017). 본 분석을 통해 DEG를 기반으로 유전자군집의 기능을 확인할 수 있으며 핵심 기능을 중심으로 저항성 유전인자 혹은 생식 생장관련 유전자를 선발하여 원하는 형질의 유전자를 발굴하는데 유용하게 사용할 수 있다. 따라서 본 연구에서 제시한 전략은 특정 처리에 따라 반응하는 유전자를 선발할 수 있으며 이를 통해 저항성 유전자의 발굴 및 유전자의 기능을 유추하는데 정상적으로 사용할 수 있음을 확인하였다.

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Fig. 5.

GSEA-based functional analysis of DEG in the GOseq step. Distribution of the top ten biological processes of DEG according to each time point. The size of the circle indicates the number of genes corresponding to each GO, and the color indicates the significance.

Supplementary Material

Supplementary materials are available at Horticultural Science and Technology website (https://www.hst-j.org).

Acknowledgements

본 연구는 한국연구재단 신진 연구 (과제번호: NRF-2019R1C1C1007472)과 중점 연구소 (과제번호: NRF-2015R1A6A1A03031413)의 지원에 의해 수행되었음.

References

1
Andrews S (2010) FastQC: a quality control tool for high throughput sequence data. In. Babraham Bioinformatics, Babraham Institute, Cambridge, United Kingdom
2
Attaran E, Major IT, Cruz JA, Rosa BA, Koo AJ, Chen J, Kramer DM, He SY, Howe GA (2014) Temporal Dynamics of Growth and Photosynthesis Suppression in Response to Jasmonate Signaling. Plant Physiol 165:1302-1314. doi:10.1104/pp.114.239004 10.1104/pp.114.23900424820026PMC4081338
3
Bitew Y, Alemayehu M (2017) Impact of Crop Production Inputs on Soil Health: A Review. Asian Journal of Plant Sciences 16:109-131. doi:10.3923/ajps.2017.109.131 10.3923/ajps.2017.109.131
4
Bolger AM, Lohse M, Usadel B (2014) Trimmomatic: a flexible trimmer for Illumina sequence data. Bioinformatics 30:2114-2120. doi:10.1093/bioinformatics/btu170 10.1093/bioinformatics/btu17024695404PMC4103590
5
Chun HJ, Park HC, Goo YM, Kim TW, Cho KS, Cho HS, Yun DJ, Chung WS, Lee SW (2011) AtCBP63, a Arabidopsis Calmodulin-binding Protein 63, Enhances Disease Resistance Against Soft Rot Disease in Potato. J Plant Biotech 38:62-68. doi:10.5010/JPB.2011.38.1.062 10.5010/JPB.2011.38.1.062
6
Conesa A, Madrigal P, Tarazona S, Gomez-Cabrero D, Cervera A, McPherson A, Szczesniak MW, Gaffney DJ, Elo LL, et al. (2016) A survey of best practices for RNA-seq data analysis. Genome Biol 17:1-19. doi:10.1186/s13059-016-0881-8 10.1186/s13059-016-0881-826813401PMC4728800
7
Ding B, Zheng L, Zhu Y, Li N, Jia H, Ai R, Wildberg A, Wang W (2015) Normalization and noise reduction for single cell RNA-seq experiments. Bioinformatics 31:2225-2227. doi:10.1093/bioinformatics/btv122 10.1093/bioinformatics/btv12225717193PMC4481848
8
Dobin A, Davis CA, Schlesinger F, Drenkow J, Zaleski C, Jha S, Batut P, Chaisson M, Gingeras TR (2013) STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner. Bioinformatics 29:15-21. doi:10.1093/bioinformatics/bts635 10.1093/bioinformatics/bts63523104886PMC3530905
9
Ewels P, Magnusson M, Lundin S, Käller M (2016) MultiQC: summarize analysis results for multiple tools and samples in a single report. Bioinformatics 32:3047-3048. doi:10.1093/bioinformatics/btw354 10.1093/bioinformatics/btw35427312411PMC5039924
10
Fumagalli M, Vieira FG, Linderoth T, Nielsen R (2014) ngsTools: methods for population genetics analyses from next-generation sequencing data. Bioinformatics 30:1486-1487. doi:10.1093/bioinformatics/btu041 10.1093/bioinformatics/btu04124458950PMC4016704
11
Kang WH, Lee J, Nam JY, Yeom SI (2018) Identification of CaLOP regulating development and growth through virus-induced gene silencing in pepper. Hortic Sci Technol 36:292-302. doi:10.12972/kjhst.20180029 10.12972/kjhst.20180029
12
Kang WH, Nam JY, Kwon JS, Yeom SI (2022a) Differential Responses of Capsicum Accessions to Foliar Blight and Root Rot by Phytophthora capsici. Hortic Sci Technol 40:85-93. doi:10.7235/HORT.20220009 10.7235/HORT.20220009
13
Kang WH, Lee J, Koo N, Kwon JS, Park B, Kim YM, Yeom SI (2022b) Universal gene co-expression network reveals receptor-like protein genes involved in broad-spectrum resistance in pepper (Capsicum annuum L.). Hortic Res 9:uhab003. doi:10.1093/hr/uhab003 10.1093/hr/uhab00335043174PMC8968494
14
Kang WH, Park B, Lee J, Yeom SI (2021) Tissue-specific RNA-seq analysis and identification of receptor-like proteins related to plant growth in Capsicum annuum. Plants 10:972. doi:10.3390/plants10050972 10.3390/plants1005097234068172PMC8152994
15
Kang WH, Sim YM, Koo N, Nam JY, Lee J, Kim N, Jang H, Kim YM, Yeom SI (2020) Transcriptome profiling of abiotic responses to heat, cold, salt, and osmotic stress of Capsicum annuum L. Sci Data 7:17. doi:10.1038/s41597-020-0352-7 10.1038/s41597-020-0352-731932587PMC6957515
16
Kang WH, Yeom SI (2018) Genome-wide identification, classification, and expression analysis of the receptor-like protein family in tomato. Plant Pathol J 34:435-444. doi:10.5423/PPJ.OA.02.2018.0032 10.5423/PPJ.OA.02.2018.003230369853PMC6200040
17
Kim D, Langmead B, Salzberg SL (2015) HISAT: a fast spliced aligner with low memory requirements. Nat Methods 12:357-360. doi:10.1038/nmeth.3317 10.1038/nmeth.331725751142PMC4655817
18
Kim DH, Kang WH, Yeom SI, Kim BD (2019) Isolation of putative pepper defense-related genes against the pathogen Phytophthora capsici using suppression subtractive hybridization/macroarray and RNA-sequencing analyses. Hortic Environ Biotechnol 60:685-699. doi:10.1007/s13580-019-00157-1 10.1007/s13580-019-00157-1
19
Kim EG, Ahn GH, Park G, Son B, Choi Y, Kang J, Lee Y, Je BI, Park Y (2021) Traits and Gene Expression Analysis of Early and Late Ripening Pollination Constant Non-Astringent Persimmon Fruits at Different Developmental Phases. Hortic Sci Technol 39:387-401. doi:10.7235/HORT.20210035
20
Kim MS, Kim D, Hong S, Kim J-R, Lim YP (2020) Dynamics of the gene regulatory networks of the inner and rosette leaves in Brassica rapa. Hortic Environ Biotechnol 61:317-326. doi:10.1007/s13580-019-00212-x 10.1007/s13580-019-00212-x
21
Kim MS, Kim S, Jeon J, Kim KT, Lee HA, Lee HY, Park J, Seo E, Kim SB, et al. (2018) Global gene expression profiling for fruit organs and pathogen infections in the pepper, Capsicum annuum L. Sci Data 5:180103. doi:10.1038/sdata.2018.103 10.1038/sdata.2018.10329870035PMC5987667
22
Kim SB, Kang WH, Huy HN, Yeom SI, An JT, Kim S, Kang MY, Kim HJ, Jo YD, et al. (2017) Divergent evolution of multiple virus-resistance genes from a progenitor in Capsicum spp. New Phytol 213:886-899. doi:10.1111/nph.14177 10.1111/nph.1417727612097
23
Kwon JS, Nam JY, Yeom SI, Kang WH (2021) Leaf-to-Whole Plant Spread Bioassay for Pepper and Ralstonia solanacearum Interaction Determines Inheritance of Resistance to Bacterial Wilt for Further Breeding. Int J Mol Sci 22:2279. doi:10.3390/ijms22052279 10.3390/ijms2205227933668965PMC7956186
24
Lee HA, Kim S, Kim S, Choi D (2017) Expansion of sesquiterpene biosynthetic gene clusters in pepper confers nonhost resistance to the Irish potato famine pathogen. New Phytol 215:1132-1143. doi:10.1111/nph.14637 10.1111/nph.1463728631815
25
Lee HA, Kim SY, Oh SK, Yeom SI, Kim SB, Kim MS, Kamoun S, Choi D (2014) Multiple recognition of RXLR effectors is associated with nonhost resistance of pepper against Phytophthora infestans. New Phytol 203:926-938. doi:10.1111/nph.12861 10.1111/nph.1286124889686PMC4143959
26
Lee HA, Yeom SI (2015) Plant NB-LRR proteins: tightly regulated sensors in a complex manner. Brief Funct Genomics 14:233-242. doi:10.1093/bfgp/elv012 10.1093/bfgp/elv01225825425
27
Lee HM, Park JS, Shin YH, Park YD (2021) Alterations in DNA methylation patterns in regenerated Chinese cabbage (Brassica rapa ssp. pekinensis) plants derived from tissue culture. Hortic Environ Biotechnol 62:605-618. doi:10.1007/s13580-020-00310-1 10.1007/s13580-020-00310-1
28
Lee J, Nam JY, Jang H, Kim N, Kim YM, Kang WH, Yeom SI (2020) Comprehensive transcriptome resource for response to phytohormone-induced signaling in Capsicum annuum L. BMC Research Notes 13:1-4. doi:10.1186/s13104-020-05281-1 10.1186/s13104-020-05281-132943083PMC7499990
29
Lee JH, Kim SA, Ahn SY, Yun HK (2019) Differential Expression of Genes in Response to Temperature Conditions Selected by Transcriptome Analysis of Grapevine Leaves. Hortic Sci Technol 37:437-447. doi:10.7235/HORT.20190044 10.7235/HORT.20190044
30
Lee S, Whitaker VM, Hutton SF (2016) Mini Review: Potential Applications of Non-host Resistance for Crop Improvement. Front Plant Sci 7:997. doi:10.3389/fpls.2016.00997 10.3389/fpls.2016.00997
31
Love MI, Huber W, Anders S (2014) Moderated estimation of fold change and dispersion for RNA-seq data with DESeq2. Genome Biol 15:550. doi:10.1186/s13059-014-0550-8 10.1186/s13059-014-0550-825516281PMC4302049
32
Martin M (2011) Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads. EMBnet journal 17:10-12. doi:10.14806/ej.17.1.200 10.14806/ej.17.1.200
33
Oh S, Choi D (2022) Receptor-mediated nonhost resistance in plants. Essays Biochem 66:435-445. doi:10.1042/EBC20210080 10.1042/EBC2021008035388900PMC9528085
34
Sanabria NM, Huang JC, Dubery IA (2010) Self/nonself perception in plants in innate immunity and defense. Self Nonself 1:40-54. doi:10.4161/self.1.1.10442 10.4161/self.1.1.1044221559176PMC3091600
35
Seo E, Kim S, Yeom SI, Choi D (2016) Genome-Wide Comparative Analyses Reveal the Dynamic Evolution of Nucleotide-Binding Leucine-Rich Repeat Gene Family among Solanaceae Plants. Front Plant Sci 7:1205. doi:10.3389/fpls.2016.01205 10.3389/fpls.2016.01205
36
Tsedaley B (2014) Late blight of potato (Phytophthora infestans) biology, economic importance and its management approaches. J Biol Agric Healthc 4:215-225
37
Wan WL, Kim ST, Castel B, Charoennit N, Chae E (2021) Genetics of autoimmunity in plants: an evolutionary genetics perspective. New Phytol 229:1215-1233. doi:10.1111/nph.16947 10.1111/nph.1694732970825
38
Wang Z, Gerstein M, Snyder M (2009) RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet 10:57-63. doi:10.1038/nrg2484 10.1038/nrg248419015660PMC2949280
39
Young MD, Wakefield MJ, Smyth GK, Oshlack A (2012) goseq: Gene Ontology testing for RNA-seq datasets. R Bioconductor 8:1-25
40
Zhang ZX, Zhao SN, Liu GF, Huang ZM, Cao ZM, Cheng SH, Lin SS (2016) Discovery of putative capsaicin biosynthetic genes by RNA-Seq and digital gene expression analysis of pepper. Sci Rep 6:34121. doi:10.1038/srep34121 10.1038/srep3412127756914PMC5069471
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