서 언
재료 및 방법
실험재료
시약
항산화 물질 추출
프레닐플라보노이드 함량 분석
항산화능 측정
세포 내 항산화능 측정
통계처리
결과 및 고찰
음양곽의 프레닐플라보노이드 함량
음양곽의 항산화능
산화적 스트레스에 대한 음양곽의 PC12 세포보호효과
세포 내 ROS 생성률 측정
서 언
P음양곽(epimedii herb)은 매자나무과(Berberidaceae) 식물로서 50종 이상이 보고되고 있으며 심산 지역 및 산지계곡의 그늘에 자생하는 다년생 초목이다(Ma et al., 2011; Lee et al., 2016). 음양곽은 2000년 전부터 한국 및 중국, 일본에서 전통적으로 약용으로 사용하였으며(Ma et al., 2011), 현재는 음양곽 중에서 삼지구엽초(EK: Epimedium koreanum), 중국음양곽(EB: E. brevicornum), 유모음양곽(EP: E. pubescens), 전엽음양곽(ES: E. sagittatum), 무산음양곽(EW: E. wushanense)의 지상부가 약전에 수록되어 약용으로 이용되고 있다(Zhao et al., 2008). 그중, 조선음양곽으로도 불리는 삼지구 엽초는 유일한 국내 자생종으로 주로 한반도의 중부 이북 쪽에서 자생한다
음양곽 및 삼지구엽초는 주요 활성지표물질인 이카린(icariin)을 함유하고 있는데 지속적 또는 과량 섭취 시 구토, 어지러움, 간독성 및 생식독성을 야기할 수 있어 약용으로만 허용되고(Wu et al., 2003), 식품에 있어서는 부정물질로 분류되었다. 하지만 식품 개발 활성화를 목적으로 최근 국내 자생종인 삼지구엽초의 지상부에 한하여 안전한 농도 내에서 침출차 및 주류의 원료 로 허용하였다[식품의약품안전처 고시 제 2014-164호(2014년 8월 28일) ‘식품의 기준 및 규격’]. 그러나 시중에 유통되는 다 양한 음양곽은 같은 속의 식물이기는 하나 서로 다른 종임에도 불구하고 생약시장 및 민간에서는 삼지구엽초와 음양곽이라는 이름을 혼용하여 혼란이 야기될 수 있다. 따라서, 천연 식물자원을 이용한 건강기능식품 및 의약품으로 활용을 위해서 지표물 질의 선정 및 물질 규명 연구는 매우 중요하다N(urul Islam et al., 2009).
한편, 식물에는 다양한 물질이 존재하여 그 물질들이 복합적으로 생리활성을 나타낸다(Giordano et al., 2004). 지표물질은 반드시 생리활성을 나타내는 물질을 의미하는 것은 아니며 기능성을 나타내는 활성물질과 따로 구분되기도 한다(Nural Islam et al., 2009). 따라서 천연식물자원의 기능성 연구는 화학적 물질규명 연구와 더불어 생물학적 기능성 연구가 병행되어야 한다 (Nural Islam et al., 2009).
음양곽의 대표적인 지표활성 물질은 프레닐플라보노이드(prenylflavonoid)로서 이카린(icariin), 에피메딘 A(epimedin A), 에피메딘 B(epimedin B), 에피메딘 C(epimedin C)가 있으며 이카리사이드 I(icariside I)과 이카리사이드 II(icariside II) 및 이 카리틴(icaritin)이 소량 함유되어있다(Fig. 1). 특히, 이카린 및 에피메딘은 음양곽에서 중요한 생물학적 또는 화학적 지표로서 건강기능식품 및 의약제품을 개발할 때 품질관리 지표로도 쓰인다(Wu et al., 2003; Liu et al., 2006; Chen et al., 2007; Nural Islam et al., 2009). 음양곽 및 이들 활성 물질은 폐경기 증상, 뼈 건강, 생식기능 강화 및 면역력 증진을 목적으로 쓰이며 최근에 는 노화 예방에 관련된 항산화 및 산화적 스트레스에 대한 세포보호효과 등의 활성이 보고되고 있다(Wu et al., 2003; Wang et al., 2010; Ma et al., 2011).
Fig. 1.
Chemical structure of major prenylflavonoids inE pimedium plants. Glu: glucosyl, rha: rhamnosyl and xyl: xylosyl
따라서 본 연구에서는 5종의 음양곽(삼지구엽초, 중국음양곽, 전엽음양곽, 유모음양곽, 무산음양곽)에 대하여 대표적 지표 활성 물질인 프레닐플라보노이드인 이카린, 에피메딘, 이카리사이드, 이카리틴 등의 함량 조사를 하여 품종 별로 함량 차이를 분석하였으며, 그 함량에 따른 항산화 활성 및 산화적 스트레스에 대한PC 12 신경세포 보호효과를 확인하였다.
재료 및 방법
실험재료
삼지구엽초는 2005년에 강원도 농업기술원에서 종자를 받아 파종한 것으로 강원도 철원지역에서 재배되었으며 2014년에 수확한 것을 실험에 사용하였다. 나머지 4종의 음양곽(중국음양곽, 전엽음양곽, 유모음양곽, 무산음양곽)은 중국에서 수집한 것으로 Table 1에 나타내었다. 실험에 사용한 음양곽은 우석대학교의 한의과대학 주영승 교수에게 품종 및 학명에 대하여 확 인 받았다. 음양곽은 실험에 사용하기 위해 모두 음건한 후 분쇄하여2 -0°C에 저장하였다.
시약
2,2'-azobis(2-amidino-propane) dihydrochloride(AAPH), 1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl(DPPH), 2,2-azino-bis(3- ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid(ABTS), potassium persulfate, sodium phosphate, ferric chloride(FeCl3), sodium acetate, 4,6-tripryridylstriazine, ascorbic acid, dimethyl sulfoxide(DMSO), penicillin, streptomycin, 3-(4,5-dimethylthiazol- 2-yl)-2,5-dimethyltetrazolium bromide(MTT), phosphoric acid은 모두 Sigma-Aldrich사(St. Louis, MO, USA)로부터 구입 하였다. 세포 배양에 필요한 RPMI 1640 배지, horse serum 및 fetal bovine serum(FBS)은 Welgene(Welgene, Daegu, Korea) 에서 구입하였다. 음양곽의 기능성 성분 분석에 사용한 표준물질 이카린, 이카리사이드 I, II, 이카리틴, 에피메딘 A, B 및 C는 ChemFaces(Wuhan, China)에서 구입하였다. Acetonitrile은 HPLC 분석등급으로 Millipore(Bedford, MA, USA)에서 구입하 여 실험에 사용하였다.
항산화 물질 추출
음양곽 유래 항산화 물질의 추출을 위해 건조시료 100g에 중량 대비 15배의 70% 에탄올을 가하여 70°C에서 6시간 환류추 출하고, ADVANTEC paper(No. 6, Advantec Co., Tokyo, Japan)를 이용하여 여과하는 과정을 3번 반복한 후 감압 농축기 (EYELA N-1000, Riakikiai Co., Ltd., Tokyo, Japan)를 하여 농축하였다. 농축된 시료는 DMSO에 100mg∙mL-1로 녹여 -70°C 에 저장하였다가 실험에 적정농도로 희석하여 사용하였다.
프레닐플라보노이드 함량 분석
음양곽의 프레닐플라보노이드는 HPLC-DAD(Dionex, Sunnyvale, CA, USA)를 이용하여 분석하였으며, sunfire C18 컬럼 (4.6×250mm, 5μm, Waters, Milford, MA, USA)을 사용하였다. HPLC 분석 조건은 Table 2에 나타내었다. 음양곽 추출물의 프레닐플라보노이드 성분은 추출물과 표준물질간의 피크 머무름 시간 및 피크 스팩트럼을 비교 분석하여 확인하였으며, 각각 의 성분 함량 분석은 내부 표준물질로 사용하여 정량하였다
항산화능 측정
ORAC 법
과산화 라디칼(peroxy radical)의 생성 및 소멸에 의한 형광 감소율을 측정하는H uang et al.(2002)의 방법을 사용하였다. 시 료 또는 표준용액 25μL와 81.6nM 형광 용액 150μL를 혼합하고 37°C에서 3분간 교반 후, 10분간 방치시켰다. 이 혼합용액에 153mM의 AAPH 25μL를 첨가한 뒤 형광광도계(microplate reader, Tecan Infinite M200, San Jose, CA, USA)로 90분간 매분 측정하였다. 형광광도계는 excitation은 485nm, emission은 520nm로 설정하였다. 음양곽 항산화능은 아스코르브산(ascorbic acid, AA)의 표준곡선을 이용하여 mg AA/dry weight(DW)로 나타내었다.
DPPH 라디칼 소거활성
DPPH 라디칼 소거활성은 농도별 시료에 0.2mM DPPH 용액을 동일 비율로 가하여 잘 혼합하고, 암소에서 30분간 방치한 후 515nm에서 흡광도를 측정하였다(Li et al., 2005). 음양곽 항산화능은 아스코르브산의 표준곡선을 이용하여 mg AA/g dry weight(DW)로 나타내었다.
ABTS 라디칼 소거활성
ABTS와 과황산칼륨(potassium persulfate)을 혼합하여 암소에 두면 ABTS 양이온이 생성되는데 추출물의 산화방지 물질 과 반응하여 양이온이 소거됨으로써 특유의 청록색이 탈색되며 이의 흡광도를 측정하여 산화방지 능력을 측정할 수 있다 (Braca et al., 2003). 7.4mM ABTS 용액과 2.6mM 과황산칼륨을 혼합하여 암소에서 약 24시간 반응시킨 후 732nm에서 흡광 도가 0.7±0.03이 되도록 phosphate buffer saline(PBS, pH 7.4)으로 희석하여 사용하였다. 희석한 용액 950μL에 농도별로 조 제한 시료 50μL를 첨가하여 잘 혼합하고 실온에 10분간 방치한 다음 732nm에서 흡광도를 측정하였다. 결과 값은 시료를 첨가 하지 않은 대조군과 비교하여 라디칼의 제거활성으로 나타냈으며, 음양곽 항산화능은 아스코르브산의 표준곡선을 이용하여 mg AA/dry weight(DW)로 나타내었다.
환원력 측정(FRAP)
FRAP(ferric reducing antioxidant power) 산화방지 활성은 sodium acetate buffer(0.3M, pH 3.6) 25mL, 40mM HCl에 용해 한 10mM 2, 4, 6-tris(2-pyridyl)-s-triazine(TPTZ, Sigma) 2.5mL, 20mM FeCl3 2.5mL 및 증류수 3mL를 섞어 혼합물을 만 든 후 실험에 사용하기 전까지 37°C로 유지하였다(Wojdylo et al., 2007). 엉겅퀴 추출물은 실험에 적당한 농도로 희석하였다. 시료액 0.05mL에 혼합물 1.5mL를 가한 후 혼합하여 37°C에서 30분간 반응시킨 후 593nm에서의 흡광도를 측정하였다. 음양 곽 항산화능은 아스코르브산의 표준곡선을 이용하여 mg AA/dry weight(DW)로 나타내었다.
세포 내 항산화능 측정
PC 12 세포 배양 및 분화
본 실험에 사용한 PC12 세포는 한국세포주은행(KCLB)에서 분양받아 사용하였다. 배지는 5% FBS과 100units/mL의 penicillin 및 100μg∙mL-1의 streptomycin을 첨가한 RPMI 1640 배지를 사용하였으며 10% CO2∙ 90% air 배양기에 37°C로 적 정시간 배양하였다. PC12 세포는 NGF(nerve factor)를 처리하여 신경세포의 형태로 분화시킨 후 실험에 사용하였다.
세포 생존율 측정
음양곽의 세포 내 독성 유발을 확인하기 위하여 MTT assay를 이용하여 세포 생존율을 측정하였다(Heo et al., 2001). PC12 세포는 96 well plate에 1×105cells/well로 분주하고 음양곽 추출물을 PC12 세포에 처리하여 12, 24 및 48시간 동안 배양하였 다. 배양한 PC12 세포에 MTT stock solution을 처리하여 37°C에서 2시간 배양한 후, MTT solubilization solution 100μL를 첨 가하여 반응을 종결시켰다. 흡광도는5 70nm에서 측정한 후, 세포 생존율은 대조구에 대한% 값으로 나타내었다.
세포막 손상 억제 효과
과산화수소로 유도한 산화적 스트레스에 대한 PC12 세포막 손상 억제효과는 음양곽 추출물을 농도별로 PC12 세포에 처리 하여 24시간 동안 전 배양 후, 250μM 과산화수소를 처리하여 3시간 동안 배양한 다음, 원심분리(250×g, 5분)하여 100μL의 상층액을 96 well plate로 옮긴 후 lactate dehydrogenase(LDH) kit(Sigma-Aldrich Chemical Co.)를 이용하여 측정하였다 (Heo et al., 2001).
ROS 생성률 측정
엉겅퀴 추출물이 PC12 세포의 산화적 손상에 대한 보호효과를 측정하기 위하여 DCF-DA assay를 실시하였다(Heo et al., 2001). PC12 세포는 96 well plate에 1×105cells/well로 분주하고 엉겅퀴 추출물을 PC12 cell에 처리하여 24시간 동안 전 배양 시킨 후, 250μM 과산화수소를 각각 3시간 동안 처리하였다. 배양 후 배지를 제거한 다음, phosphate buffered saline(PBS) buffer로 희석된 10μM DCF-DA를 가하고, 40분간 배양하였다. PBS buffer로 2회 washing한 다음 200μM 과산화수소를 가 하고, 3시간 뒤에 fluorescence microplate reader(Agilent Technologies, Inc., Santa Clara, CA, USA)를 사용하여, excitation 파 장 485nm와 emission 파장 535nm에서 측정하였다.
통계처리
본 실험연구에서 얻어진 모든 측정치는 평균값과 표준편차로 나타내었고, 각 평균치간 차이에 대한 유의성은 SPSS program(ver. 19.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)을 이용하여 ANOVA를 실시하고, Duncan’s multiple range test로 각 군의 평 균 차이에 대한 사후 검정을 하였으며, 통계적 유의성을5 % 수준에서 분석하였다.
결과 및 고찰
음양곽의 프레닐플라보노이드 함량
본 연구에 사용된 5종의 음양곽은 다른 종임에도 불구하고 외관이 비슷하여 약용 및 식용으로 이용 시에 구분이 어려우므로 지표물질을 활용하여 구분하는 연구가 필요하다(Chen et al., 2007). 따라서 본 연구에서는 5종의 음양곽에 대하여 이카린, 에 피메딘, 이카리사이드, 이카리틴 등 프레닐플라보노이드의 함량을 비교 분석하였다(Fig. 2, Table 3).
분석 결과, 5종의 음양곽 모두 프레닐플라보노이드 중 이카린이 가장 다량 함유되어 있었다. Wu et al.(2003)의 리뷰에 의하 면 자생지역 및 수확시기에 따라 달라지기는 하지만 42종의 다양한 음양곽의 이카린 평균 함량은 0.34% 정도로 보고하였다. 또한 대한약전에 의하면 약용으로 사용되는 음양곽은 지상부의 건조 중량 대비 이카린이 0.3% 이상 함유된 것으로 고지되어 있다(MFDS approval database, 2016). 음양곽은 예로부터 현재까지 민간에서 전통적으로 식품 형태(차 또는 담금주 등)로 많 은 사람이 섭취하고 있는 반면 식품의 기준 및 규격에는 식품원료로 쓰이는 삼지구엽초의 사용 농도는 ‘안전한 범위 내’라고 모 호하게 명시되어 있어 소비자에게 혼란을 야기할 수 있다. 따라서 국내에서 식용 및 약용으로 사용되는 음양곽의 성분의 정성 및 정량 연구는 매우 중요하다
본 연구에서 음양곽에의 주요 플라보노이드 함량 분석 결과 검출된 플라보노이드의 총 량은 삼지구엽초 > 유모음양곽> 무 산음양곽 > 전엽음양곽 > 중국음양곽 순서로 나타났다(Table 2). 또한 이카린은 삼지구엽초에 0.37%로 가장 많이 함유된 것으 로 확인되었으며, 연구에서 사용된 5종의 음양곽의 이카린 함유량은 삼지구엽초(3.66 ± 0.17mg∙g-1 DW) > 유모음양곽(1.87 ± 0.02mg∙g-1 DW) = 무산음양곽(1.98 ± 0.02mg∙g-1 DW) < 전엽음양곽(1.60 ± 0.02mg∙g-1 DW) > 중국음양곽(0.75 ± 0.02mg∙g-1 DW) 순서로 나타났다(p < 0.05). 한편, 삼지구엽초에는 다른 4종의 음양곽에는 검출되지 않은 히페린이 1.24 ± 0.06mg∙g-1 DW 함유되어있었다. 또한 삼지구엽초는 이카린과 더불어 지표물질로 활용되는 에피메딘 A(1.33 ± 0.02mg∙g-1 DW), 에피메딘 B(1.98 ± 0.02mg∙g-1 DW) 및 에피메딘 C(1.31 ± 0.01mg∙g-1 DW)의 함량이 가장 많이 함유된 것으로 확인되 었다. 이들 프레닐플라보노이드는 플라보놀 배당체가 프레닐화된 것으로 다양한 in vitro 및 in vivo 활성이 보고되고 있다(Ma et al., 2011). 최근에는 특히 노화와 관련이 있는 항산화 활성 및 신경보호효과에 대한 연구가 지속되고 있어 이를 확인하기 위 하여 항산화 활성 및 PC12 신경세포 보호효과를 측정하였다.
Fig. 2.
HPLC chromatogram of the extracts from five species of Epimedium genus. (A) Eight standards mixture, (B) Epimedium koreanum , (C) E. brevicornu, (D) E. pubescens , (E) E. sagittatum and (F) E. wushanense . 1: hyperin, 2: epimedin A, 3: epimedin B, 4: epimedin C, 5: icariin, 6: icariside I, 7: icasride II and 8: icaritin.
음양곽의 항산화능
5종 음양곽의 항산화능을 ORAC, DPPH, ABTS 및 FRAP 법을 이용하여 측정하였으며, 아스코르브산 당량의 값으로 나타 내었다(Table 4). ORAC 법으로 평가한 결과 삼지구엽초와 전엽음양곽의 항산화능이 각각 25.64 ± 0.11, 25.71 ± 0.15μg AA/g DW로 가장 뛰어난 것으로 나타났으며(p < 0.05), ABTS 결과도 ORAC 결과와 동일하게 삼지구엽초와 전엽음양곽의 항 산화능이 각각 27.17 ± 0.21, 26.52 ± 0.23μg AA/g DW로 가장 뛰어난 것으로 나타났다(p < 0.05). DPPH 법 및 FRAP 법으로 평가한 결과 삼지구엽초의 항산화능이 각각 23.89 ± 0.41, 31.19 ± 0.36μg AA/g DW 가장 뛰어난 것으로 나타나 모든 항산화 능 시험법에서 삼지구엽초가 가장 뛰어난 것으로 확인되었다(p < 0.05). 또한 중국음양곽의 항산화 활성이 모든 항산화시험법 에서 가장 낮은 활성을 나타내었는데 이는 플라보노이드의 함량과 연관이 있는 것으로 판단된다. Kim et al.(2007)의 연구에서 삼지구엽초를 다양한 추출조건에 따라 이카린의 함량 및 항산화 활성을 측정한 결과 이카린 농도 의존적으로 항산화 활성이 늘어나는 것으로 보고되었다. 본 연구에도 이카린 함량이 가장 많은 삼지구엽초의 항산화 활성이 가장 우수하였으며 이카린이 가장 적게 함유된 중국음양곽의 항산화 활성이 가장 낮게 측정되었다. 다만, 유모음양곽 및 전엽음양곽의 이카린 및 기타 플라 보노이드 함량이 무산음양곽에 비하여 적었음에도 불구하고 항산화 활성이 높게 측정된 것은 이카린을 포함한 플라보노이드 이외의 페놀성 화합물을 더 많이 함유하고 있기 때문으로 사료된다. Wu et al.(2003)는 음양곽에서 분리한 프레닐플라보노이 드 및 플라보노이드글루코시드 중에 히페린이 간세포 내 항산화 활성이 가장 뛰어난 것으로 보고하였는데, 본 연구에서 히페 린은 삼지구엽초에만 함유되어 있어 삼지구엽초의 강력한 항산화능에 히페린도 크게 기여했을 것이라 판단된다.
한편 항산화 시험법 중에서 DPPH 법과 ABTS법은 간편하고 신속하며 재현성이 높으며 페놀성 화합물의 함량과 큰 상관관 계가 있는 것으로 보고되고 있다(Paixão et al., 2007). 반면 ORAC 법은 AAPH의 분해에 의해 생성되는 ROO∙(peroxyl radical) 에 형광 프로브을 붙여 시간에 따라 형광감도가 감소되는 정도를 측정하는 것으로 항산화제를 처리하면 형광물질이 비형광물 질로 산화되어 형광 수치가 떨어지게 되는데, 다른 항산화 시험법에 비하여 민감하지만 다소 비싼 장비가 필요한 것이 단점이 다(Huang et al., 2002). 한편 FRAP 법은 자유기 소거능 매커니즘이 아닌 3가 철이 항산화제에 의해 2가 철로 환원되는 원리를 이용하는 실험으로 FRAP 값이 높을수록 철을 환원시키는 능력이 높은 것으로 항산화능이 우수하다고 평가할 수 있다. FRAP 값은 페놀성 화합물, 플라보노이드의 함량 및 라디칼 소거능과 상관성이 높다고 보고되고 있다(Wang et al., 2016; Mumivand et al., 2017).
퇴행성 신경질환인 치매는 ROS로 인한 산화적 독성 때문에 유발되는 것으로 알려져 있는데Ja(ng et al., 2016), 치매의 원인 물질인 아밀로이드 베타는 특이적으로 철, 구리 및 아연 등과 같은 금속이온과 화학작용을 통하여 과산화수소를 생성하고 최 종적으로 산화적 독성이 있는 OH 자유기를 생성하여 신경세포의 손상을 야기한다고 보고되고 있다(Opazo et al., 2002; Gerard et al., 1994). 본 연구에서 사용된 5종의 음양곽은 자유기 소거능 및 철 이온의 환원력이 뛰어나 신경세포 내에서 철 이 온 환원 및 자유기 소거 매커니즘에 작용할 것으로 예상되어 신경세포내에서 산화적 독성에 대한 보호효과를 측정하였
Table 4. Antioxidant activity of five Epimedium species |
The values are mean ± SD of three experimental results. xxMean separation within columns by Duncan’s multiple range test ( p < 0.05). |
산화적 스트레스에 대한 음양곽의 PC12 세포보호효과
MTT 법을 이용하여 5종의 음양곽 추출물의 세포생존율 및 과산화수소로 유도된 산화적 스트레스 상태에서 PC12 신경세 포에 대한 보호 효과를 측정한 결과는 Fig. 3과 같다. 과산화수소를 처리한 처리군에서는 대조군 100% 대비 48%의 생존율을 나타냈고 과산화수소와 음양곽 추출물을 10, 50, 100μg∙mL-1 농도로 함께 처리하였을 때 5종의 음양곽 모두 농도 의존적으로 신경세포 보호효과가 증가하였다(p < 0.05). 또한 모든 실험 농도에서 삼지구엽초의 세포보호효과가 뛰어났는데 이는 삼지구 엽초에 항산화 기능을 나타내는 히페린 및 프레닐플라보노이드의 함량이 많기 때문으로 사료된다 .
신경세포는 특이적인 신호전달을 위해 다른 세포에 비하여 상대적으로 많은 지질성분을 함유하고 있어 산화적 스트레스에 매우 취약한 것으로 알려져 있다(Heo et al., 2008). 따라서 신경세포막 손상에 대한 음양곽 추출물의 보호효과를 확인하기 위 하여 LDH 법을 이용하여 세포보호효과를 확인하였다(Fig. 4). 세포 괴사 및 세포 사멸이 일어날 때 세포막이 손상되면 LDH가 방출되는데(Jang et al., 2016), 무처리군의 LDH 방출량은 18% 정도인데 반해 과산화수소를 처리한 시료에서는 48%의 방출 량을 보여 과산화수소에 의해 LDH 방출량이 약 30% 정도 증가하였다. 과산화수소와 음양곽 추출물을 함께 처리하였을 때 10μg∙mL-1 농도에서는 과산화수소 처리군과 차이가 없었으나 50μg∙mL-1 농도에서는 세포막의 LDH가 9-18% 감소하였으며, 100μg∙mL-1 농도에서는 17-25% 감소하여 농도의존적으로 세포보호효과가 증가하는 것을 확인하였다(p < 0.05). 또한 MTT 결과와 마찬가지로 삼지구엽초의 활성이 가장 뛰어난 것으로 확인되었다p( < 0.05).
세포 내 ROS 생성률 측정
음양곽 추출물이 과산화수소에 의해 유도된 PC12 세포 내 ROS 생성 저해 활성을 측정한 결과는 Fig. 4와 같다. 과산화수소 를 처리한 처리군에서는 대조군 100% 대비 142%의 DCF를 형성했고 과산화수소와 음양곽 추출물을 10, 50, 100μg∙mL-1 농 도로 함께 처리하였을 때 5종의 음양곽 모두 농도 의존적으로 과산화수소 처리구에 비해 산화적 스트레스의 감소효과를 보였 다(p <0.05). 또한 세포생존율 및 세포막 보호효과의 결과와 마찬가지로 모든 실험 농도에서 삼지구엽초의 세포보호 효과가 뛰 어났다. 특히, 삼지구엽초 추출물을 100μg∙mL-1 농도로 처리한 경우 87%로 나타나 약 55% 정도의 산화적 스트레스 감소 효과를 보였다.
Fig. 3.
Protective effect of extracts from five Epimedium species against H2O2-inuced cytotoxicity in PC12 cells. Each bar represents mean ± SD of three separate replications. Letters indicate significant differences according to Duncan’s multiple range test (p < 0.05). EK: E. koreanum, EB: E. brevicornu, EP: E. pubescens, ES: E. sagittatum and EW: E. wushanense.
음양곽은 전통적으로 노화예방 및 강장에 효과적인 것으로 보고되어 있으며, 이는 최근에 항산화 및 신경보호 작용에 관하 여 과학적으로 검증되고 있다. 특히 음양곽의 주요 생리활성 물질인 동시에 지표물질인 이카린은 신경세포의 타우 단백질의 발 현을 조절하여 신경독성을 줄여주는 것으로 확인되었다(Zeng et al., 2010; Song et al., 2016). 또한 이카린은 과산화수소 및 아 밀로이드 베타로 인한 산화적 스트레스에 대한 세포사멸을 억제하여 세포보호활성을 나타냈으며(Li et al., 2011; Zhang et al., 2015), 아밀로이드 베타로 치매를 유발한 쥐의 기억력을 향상시켜주는 효과가 확인되었다(Urano et al., 2010). Wu et al.(2003)에 의하면 음양곽은 신경면역시스템에 관여하여 신경병증을 예방하는 것으로 확인되었다. 이처럼 음양곽이 함유한 각각의 항 산화 플라보노이드의 신경세포 보호활성 때문에 음양곽 추출물이 뛰어난 항산화 활성 및 산화적 스트레스에 대한 신경세포 보 호활성을 나타내는 것으로 판단된다.
Fig. 4.
Protective effect of extracts from five Epimedium species against H2O2-inuced membrane damage in PC12 cells. Each bar represents mean ± SD of three separate replications. Letters indicate significant differences according to Duncan’s multiple range test (p <0.05). EK: E. koreanum, EB: E. brevicornu, EP: E. pubescens, ES: E. sagittatum and EW: E. wushanense.
Fig. 5.
Reactive oxygen species production in PC12 cells damaged by H2O2-induced oxidative stress and treated with extracts from five Epimedium species. Each bar represents mean ± SD of three separate replications. Letters indicate significant differences according to Duncan’s multiple range test (p <0.05). EK: E. koreanum , EB: E. brevicornu , EP: E. pubescens , ES: E. sagittatum and EW: E. wushanense.
삼지구엽초 또는 음양곽에 대한 연구는 중국의 연구가 대부분이며, 국내에서는 소비자들의 사용 빈도에 비하여 미약한 실정 이다. 또한 생리활성 연구는 추출방법 및 부위에 따른 활성 연구가 대부분으로 소비자의 혼돈을 야기할 수 있는 같은 종, 다른 속에 해당하는 음양곽들의 화학적 및 생물학적 차이를 분석한 연구는 매우 부족한 실정이다. 본 연구는 서로 다른 5종의 음양 곽의 주요 프레닐플라보노이드 분석 및 그에 따른 항산화 활성 및 신경세포 보호활성을 확인하여 일상에서 음양곽 및 삼지구 엽초의 활용에 도움이 되는 기반 연구로 가치가 있다고 판단된다. 추후 연구에서는 음양곽의 주요 활성성분으로 여겨지는 프 레닐플라보노이드 각각의 세포 내 산화방지 메커니즘 및 세포사멸 기전에 대하여 분자생물학적인 연구가 이어져야 할 것으로 판단된다.
