서 언

배(Pyrus spp.)는 사과, 복숭아, 딸기 등과 함께 장미과에 속하는 온대 과수 작물의 하나이며, 유럽, 미국, 아프리카에서 재배 되는 서양배(P. communis L.)와 동양배로 크게 대별할 수 있다. 동양배는 우리나라, 중국 남부, 일본 등지에 재배되는 남방형 배(P. pyrifolia)와 중국과 일본의 북부지역 및 러시아 극동지역에서 재배되는 북방형 배(P. ussuriensis, P. bretschneideri)로 나누어 지며 P. communis와 P. pyrifolia가 가장 많이 재배되고 있다(Bell, 1990). 우리나라의 배 재배면적은 2014년 현재 13,127 ha로 매 년 감소 추세에 있으나 신품종 개발과 재배법 개선을 통해 생산량은 302,731톤으로 증가 추세에 있다(www.mafra.go.kr). 2016 년 7월 현재 품종생산 수입판매 신고된 548건과 품종보호 출원 및 등록된 48품종이 유통되고 있다(www.seed.go.kr).

배와 같은 목본류 작물의 신품종 심사는 나무와 가지, 잎, 꽃, 과실 등에서 발현되는 59개 형질을 조사하고 기존 품종과 상 호 비교하여 구별성을 판단하고 있다. 그러나 목본류의 경우 품종 특성 조사에 소요되는 기간이 장기간 소요되기 때문에 대 부분 육종가가 육성한 포장에서 직접 조사하는 현지심사 방식을 채택하고 있다. 따라서 형태적 특성조사에 의한 품종보호 출 원품종, 대조 및 표준 품종에 대한 정확한 평가가 어렵다. 이러한 문제점을 보완할 수 있는 방법이 분자표지 인자를 활용하여 품종별 데이터 베이스를 구축하고 기 알려진 품종에 대한 유전적 유연관계를 설정하는 것이다. 국제 식물 신품종 보호 동맹 (UPOV: International Union for the Protection of New Varieties of Plants)에서도 분자표지에 의한 품종별 데이터베이스 구축에 대한 가이드라인을 제시하고 있으며, 반복 재현성 및 품종별 다형성 정도가 높은 microsatellite나 single nucleotide polymorphism(SNP) 마커의 활용을 권장하고 있다(UPOV, 2010). 그러나 SNP 마커를 배의 품종별 데이터베이스 구축에 활용한 경우는 품종 식별 에 적합한 SNP 정보가 부족하기 때문에 국내외 연구자에 의해 거의 보고되지 않고 있다. 그러나 microsatellite 마커의 경우 배 품종 식별 및 유전자원의 다양성 평가의 경우 일본에서 Kimura et al.(2002)이 보고한 이래, 배의 과일 통조림, 주스, 건조된 과 일과 같은 품종보호품종의 가공품의 분석에까지 연구 범위를 확대하고 있다(Yamamoto et al., 2006). 이러한 분석에 주로 활용 된 마커는 2000년대 초반에 개발된 microsatellite 마커를 활용하였다는 점이며 몇몇 마커의 경우 대립유전자의 밴드 양상이 복 잡하고 다형성 정도가 낮아 유전적 거리가 좁은 최근 품종의 식별이 어렵다는 문제점이 제기되었다. 그러나 UPOV에서 제안 한 유전자 분석 지침서에서는 품종별 DNA 데이터베이스를 작성하기 위해서는 염기서열 정보가 논문 등을 통해 알려져 있고 여러 가지 분석기기, 실험실 및 실험자에 따라 동일한 결과를 나타내는 마커의 활용을 제안하고 있다(UPOV, 2010). 따라서 기 존에 개발되었던 배 품종 식별용 마커보다 다형성 정도가 높으면서 대립유전자의 패턴이 우수하고 반복 재현성이 높은 마커 의 개발이 필요한 것으로 판단되었다. 이들 마커를 대상으로 우리나라에서 육성된 배 품종보호출원 및 등록품종과 일본 등 해 외에서 육성된 품종 및 유전자원을 대상으로 정밀도 높은 데이터베이스 구축을 통한 유전적 거리의 추정은 향후 배 신품종 개발의 기초 자료로 활용될 수 있을 뿐만 아니라 품종보호권 강화 등에 크게 기여할 수 있으리라 판단된다.

따라서 본 연구에서는 국내외에서 재배되고 있는 배 품종 및 유전자원에 유전적 근연도를 조사하기 위하여, 380개 이상의 microsatellite 마커를 활용하여 대립유전자의 다형성 및 마커 별로 증폭되는 대립유전자의 패턴 등이 우수한 마커를 선정하고, 이를 국내외에서 재배되고 있는 배의 품종 및 유전자원에 대한 DNA 프로파일데이터 베이스 구축에 대한 일련의 연구를 수 행하여 얻어진 결과를 보고하는 바이다.

재료 및 방법

Microsatellite 분석

본 연구에서는 농촌진흥청 국립원예특작과학원에서 수집 보존하고 있는 배 유전자원 및 품종 72개(P. pyrifolia 54 개, P.communis 4개, P. ussuriensis 6개, P. bretschneideri 6개, P. betulifolia 2개)를 공시하여 microsatellite 마커의 분석 재료로 활 용하였다(Table 1). 공시 종의 어린 잎을 액체질소를 이용하여 마쇄한 다음 NucleoSpin®PlantⅡ(Cat. 740 770.250, Macherey- Nagel GmbH & Co., KG, Deutsch) 키트를 이용하여 genomic DNA를 분리 하였다. 추출된 DNA는 1.5% 아가로스젤에서 전기 영동하여 DNA 농도를 확인한 후 μL당 20ng의 농도로 희석하여 PCR 분석에 이용하였다.

Table 1. List of pear cultivars and germplasm samples genetically characterized using microsatellite markers.

배 품종식별에 적합한 microsatellite 마커를 선발하기 위하여, 동양배로 분류되는 ‘Kinchaku’, ‘Gongjucheongsilri’, ‘Yasato’, 서양배인 ‘Passa Crassane’, ‘Beze Ligelya’, ‘Bosc’, ‘Abate fetel’, 미국 도입종인 ‘OPR - 264’와 387개의 microsatellite 프라이머를 이용하여 PCR하고 DNA증폭 산물을 QIAxcel Advanced System(Cat. 9001941, QIAGEN, Deutsch) 을 이용하여 전기 영 동한 다음 컴퓨터 프로그램(QIAxcel ScreenGel)에 의해 프라이머별 다형성 정도 및 대립유전자의 질적 특성을 Table 2의 조 사 기준에 의하여 분류하였다. Microsatellite의 대립유전자 특성이 단일밴드이거나 강한 주 밴드를 나타내는 분자표지를 선정 하여 프라이머의 정방향에 FAM, VIC, NED, PET의 화학 물질 중 한가지로 형광표지 하였다. 배 72품종 및 유전자원에 대한 DNA 프로파일 데이터베이스를 구축하기 위한 PCR 조성액은 게놈 DNA 20ng, 0.1μM의 형광 표지된 microsatellite primer, 2.0μL dNTP mixture(2.5mM), Taq polymerase 1.0U, 2.5μL의 10 × PCR buffer(50mM KCl, 20mM Tris - HCl, pH 8.0, 2.0mM MgCl2)에 초순수를 첨가하여 전체 부피를 30μL로 조절하였다. PCR(C1000, BioRad, USA) 조건은 94°C에서 30초간 denature 한 후, 55°C에서 30초간 annealing, 72°C에서 45초간 extension을 40cycle 수행하였다. Microsatellite 마커에 따른 배 품종별 대립 유전자의 크기를 추정하기 위하여, PCR 증폭산물1.0μL와 탈이온된 포름아마이드(deionized formamide) 10μL, size marker(LIZ500 size standard) 0.25μL를 혼합하고 94°C에서 2분간 변성시킨 후 자동염기서열분석기(Genetic Analyzer 3130XL, Applied Biosystems, Foster, USA)를 활용하여 전기 영동한 다음 GeneMapper(version 3.7) 프로그램(Applied Biosystems, Foster, USA)을 이용하여 각 마커 별로 대립유전자의 수와 대립유전자의 크기를 결정하였다 .

유전적 다양성 분석

Microsatellite 마커의 다양성을 조사하기 위하여 아래의 공식을 이용하여 Polymorphism information content(PIC) 값을 산 출하였다. 식에서 Pij는 마커 i의밴드들 중에서 j번째 공통 밴드 패턴의 빈도수이다(Anderson et al., 1993).

그리고 NTSYSpc(version 2.10b)(Rohlf 2000) 컴퓨터 프로그램을 이용하여 Jaccard 방법에 준하여 유전적 유사도 값을 계 산한 다음 unweighted pair-group method with arithmetical average(UPGMA)(Sneath and Sokal 1973) 방법으로 집괴 분석 하고 계통도를 작성한 다음 배 품종 및 수집종별 유전적 다양성 및 유연 관계를 비교 분석하였 다.

결과 및 고찰

Microsatellite 분석

배 품종 식별 및 유전적 다양성 분석에 적합한 microsatellite 마커를 선정하기 위하여 일본(Nishitani et al., 2009), 중국(Fan et al., 2013; Yue et al., 2014), 미국(Hemmat et al., 2003), 및 국제 장미과 작물 게놈 데이터베이스(www.rosaceae.org)에서 보 고된 387개의 microsatellite 프라이머와 식물학적 특성이 다른 8개의 배 유전자원 및 품종(‘Kinchaku’, ‘Gongjucheongsilri’, ‘Yasato’, ‘Passa Crassane’, ‘Beze Ligelya’, ‘Bosc’, ‘Abate fetel’, ‘OPR - 264’)에 대한 프라이머별 다형성 정도 및 대립유전자의 질적 특성을 조사하였다(Fig. 1 and Table 2). 총 387개의 microsatellite 마커 중에서 360개는 증폭되는 대립유전자의 밴드 양 상이 복잡하거나 증폭반응이 미약하였고 일부 프라이머는 PCR 반응이 일어나지 않은 양상을 나타내었다. 그러나 나머지 27 개의 프라이머 중에서 11개는 품종 별로 하나의 명확한 주된 밴드를 나타내었고, 16개는 부가적인 밴드를 나타내면서 강한 주 된 피크를 보이는 것으로 나타났다. 따라서 11개의 프라이머를 대상으로 정방향의 5’ - 말단에 형광물질인 FAM, VIC, NED, PET를 각각 표지하여 배 72개의 품종 및 유전자원의 genomic DNA와 PCR하고 자동염기서열분석기를 이용하여 전기 영동 한 다음 다형성 정도를 조사한 바 (Table 3), microsatellite 프라이머에 따라 검출된 대립유전자의 수는 4 - 22개로 다양하게 나 타났으며 총 133개의 대립유전자가 검출되었고, 마커당 평균 대립유전자의 수는 12.1개로 분석되었다. 각 마커 별 공시 품종의 유전적 다형성 정도를 나타내는 PIC 값은 0.557 - 0.879까지 다양한 범위에서 분포하였으며, 평균값도 0.743으로 아주 높은 경향을 나타내었다. 특히, 10개 이상의 대립유전자를 가지면서 PIC 값이 0.70 이상인 TsuENH002, TsuENH019, CH01H01, GD - 144, NAUpy32c, Pyrus_Contig3a, Pyrus_Contig4c, Pyrus_Contig5c 마커는 배 유전자원 특성 평가 및 배 가공품의 품종 진위성 확인 및 농산물의 도난 사건 등에 효과적으로 활용될 수 있을 것으로 나타났다 .

Table 2. Allele quality of polymorphic microsatellite markers analyzedi n this study.

zSingle product, only weak or relatively strong stutter bands yStrong major polymorphic product with additional strong bands,a nd multi-locus or weak but scoreable products xLadders of bands at equal intensity, but which may contain weak scoreable products wBands of unexpected size or additional bands, and very weak bands or no amplification products

Table 3. Repeat motif, number of alleles, and polymorphism information content (PIC) of microsatellite markers selected for genetic characterization of pear cultivars and germplasm samples.

Microsatellite 마커를 이용한 유전적 다양성 분석에 대한 연구는, 일본의 Kimura et al.(2002)이 서양배와 동양배 등 여러 가 지 유형의 품종을 대상으로 9개의 microsatellite 마커(KA16, KU10, BGA35, BGT23b, NH004a, NH011b, NH013a, NH014a, NH015a)로 분석하였을 때 평균 대립유전자의 수는 14.8개임을 보고한 이래, 중국의 Bao et al.(2007)은 6개의 SSR 마커 (BGA35, KU10, BGT23b, NH004a, NH011b, NH015a)로 중국, 일본, 한국 등에서 수집한 98개의 배 유전자원 및 품종을 검 정한 결과 평균 28개의 대립 유전자가 검출됨을 제시하였다. 이들 연구자의 공통점은 분석에 활용된 유전자원의 종류만 다르지 9개의 마커 중 6개가 일치한다는 점이다. 그러나 최근에 여러 연구자에 의해 배와 사과 등에서 유래된 다수의 microsatellite 마커가 개발되면서 이들을 대상으로 다형성 정도가 높고 대립유전자의 패턴이 우수하면서 반복 재현성이 높은 마커의 선정은 배 품종의 동일성 여부 및 유전자원 특성 평가에 안정적으로 활용될 수 있다는 장점이 있다. 따라서 본 연구에서는 이러한 기준 에 적합한 11개의 마커를 선정할 수 있었다. 이 마커들은 일본에서 Nishitani et al.(2009)이 개발한 3개, Hemat et al.(2003)이 개 발한 2개, Fan et al.(2013)이 개발한 1개, 장미과 작물 게놈데이터베이스에서 선발한 5개로 구성되어 있다. Nishitani et al.(2009) 은 TsuENH002, 019, 071 마커를 동양배 11품종과 서양배 11품종에 대하여 분석하였을 때 대립유전자의 수는 1-4개의 범위 에 분포함을 보고하였고, Fan et al.(2013)은 배 whole genomic sequence를 통해 개발한 마커 NAUpy32c를 서양배 1품종과 일본 및 중국에서 유래된 동양배 2품종 및 Pyrus 속 유전자원 4점에 대하여 분석하였을 때 4개의 대립유전자가 나타남을 보고 한 바 있다. 그러나 본 연구에서 이 마커를 대상으로 배 품종 및 유전자원 72개에 대하여 분석하였을 때 대립유전자의 수가 4-13 개가 분포하는 양상을 나타내어 이들 연구자보다 대립유전자의 수가 많이 검출되었는데 이는 분석에 활용된 배 품종 및 유전 자원의 유전적 조성과 대립유전자의 검출에 활용된 분석기기가 다른 데서 비롯된 결과라고 추정된다. 한편, Hemmat et al. (2003)이 사과의 유전자 지도 작성에 활용했던 사과 유래의 microsatellite 마커인 CH01H01과 GD-144 및 장미과 식물 게놈 데이터베이스에서 선발한 Pyrus_contig3a, Pyrus_contig4c, Pyrus_contig5c, Pyrus_contig29a, Pyruscontig29b의 경우 지금까 지 유전자원의 특성 평가나 품종식별에 활용되지 않았던 새로운 마커로서 이를 본 연구에 공시된 재료에 대해 분석하였을 때 대립유전자의 수가 4-22개로 많고, PIC 값도 0.621-0.878까지 높게 나타났다. 따라서 본 연구에서 최종 선정된 배 품종식별용11개의 microsatellite 마커는 배 뿐만 아니라 다양한 장미과 작물의 유전적 유연관계 설정 및 품종별 데이터베이스 작성에 효 과적으로 사용될 수 있을 것으로 추정된다 .

품종식별력 검정 및 유전적 유사도 분석

배 및 사과에서 유래된 microsatellite 마커 중에서 다형성 정도가 높으면서 대립유전자의 밴드 패턴이 우수한 11개를 이용하 여 배 72품종 및 유전자원에 대한 유전적 유사도 정도를 분석한 바(Fig. 2), 공시품종 및 유전자원에 대한 전체 유사도 지수는 0.07-1.00으로 나타났다. 유전적 유사도 지수 0.21에서 4개의 대그룹으로 분류할 수 있었다.

Ⅰ그룹에는 ‘Jinhwang’ 등 55품종이 포함되었으며, 유사도 지수 0.32에서 2개의 소그룹으로 구분할 수 있었다. Ⅰ- 1 그룹은 우리나라에서 육성되어 품종보호 등록된 21품종(‘Jinhwang’, ‘Manpung’, ‘Noksu’, ‘Sodam’, ‘Hwasan’, ‘Sweet Skin’, ‘Gamro’,‘Minibae’, ‘Wongyo Na-Gihoo No.1’, ‘Shinwha’, ‘Hwanggeum’, ‘Josaenghwanggeum’, Sooyoung’, ‘Joy Skin’, ‘Changjo’, ‘Hanareum’, ‘Sinil’, ‘Solmi’, ‘Suhwang’, Sincheon’, ‘Geumchonjosaeng’)과 중간모본인 ‘Wongyo Na - 11’과 일본품종인 ‘Niitaka’ 등 20품종이 포함되었다. 품종 육성 계보를 볼 때 일본에서 육성된 ‘Kosui’, ‘Hosui’, ‘Okusankichi’, ‘Sinsui’, ‘Niitaka’, ‘Nijisseiki’와 우리나라에서 육성된 ‘Hwasan’과 ‘Danbae’ 품종이 교배모본으로 활용된 품종이 속하였다. Ⅰ- 2 그룹은 우리나 라에서 육성되어 품종보호 등록된 ‘Yeongsan’, ‘Wonhwang’, ‘Mihwang’, ‘Mansoo’, ‘Manhwang’, ‘Sweet Cost’, ‘Gamcheon’ 등 7품종과 일본에서 육성된 ‘Okusankichi’ 등 5품종이 속하였으며, 특이하게 동양계 배중에서 P. bretschneideri에 속하는 ‘Laiyangcili’가 포함되었다. Ⅰ- 2 그룹에 속하는 품종들의 육성 계보를 볼 때 ‘Danbae’와 ‘Okusankichi’가 주로 교배모본으로 활용된 품종이 분포되었다. 특히, ‘Gamcheon’과 ‘Mihwang’의 경우 본 연구에서 선발된 분자표지에 의해서 구분이 되지 않았 는데, 두 품종의 육성 계보를 볼 때 양친 중에 ‘Okusankichi’가 부본 또는 모본으로 활용되었기 때문에 나타난 결과라고 추정되 며, 향후 두 품종의 형태적 특성이나 분자 마커의 수를 확대 분석하여 품종의 동일성 여부를 판단해야 될 것으로료 사된다.

Ⅱ 그룹은 우리나라, 중국, 일본에서 수집한 P. ussuriensis 6점과 중국에서 수집한 배 유전자원 P. bretschneideri 5점이 동일 한 그룹에 분포하였다. 분자 마커를 활용하여 배 유전자원을 대상으로 군집분석 하였을 때 종에 따라 뚜렷하게 구분되지 않다 는 것이 여러 연구자에 의해 지적되고 있다. Kimura et al.(2002)은 종이 다른 동양배와 서양배 60품종을 9개의 microsatellite 마커로 분석하였을 때 종에 따라 명확히 그룹화 되지 않는다고 하였다. Cho et et al.(2009)도 amplified fragment length polymorphism(AFLP) 마커를 활용한 배 유전자원의 유연관계 분석에서도 이와 유사한 연구결과를 발표한 바 있는데, 본 연구 에서도 Ⅰ그룹의 P. pyrifoliai내에 P. bretschneideri에 속하는 ‘Laiyangcili’ 분포하거나, Ⅱ 그룹내에 P. ussuriensis 6점과 P. bretschneideri 5점이 혼재하여 그룹화되는 양상을 나타내어 이들 연구자의 연구결과를 확인할 수 있었다 .

Ⅲ 그룹은 P. betulaefolia에 속하는 ‘OPR - 113’과 ‘OPR - 165’가 포함되었으며, Ⅳ 그룹은 P. communis에 속하는 ‘Passe Crassane’, ‘Beze Ligelya’, ‘Bosc’, ‘Abate fetel’ 등 4품종이 분포하였다. Ⅲ 그룹의 P. betulaefolia는 P. bretschneideri의 기원인 것으로 Challice and Westwood(1973)에 알려져 있으나, 본 연구에서 활용된 microsatellite 마커에 의해 독립적인 하나의 군으 로 그룹화되는 것으로 보아 이 두 종간에는 유전적으로 거리가 먼 것으로 확인하였는데, Bao et al.(2007)도 중국배 유전자원을 microsatellite 마커 6개로 분석하였을 때 P. betulaefolia와 P. bretschneideri는 종간에 유전적으로 거리가 먼 독립적인 군으로 분포함을 보고한 바 있다. 본 연구에서도 이들 연구자와 전혀 다른 microsatellite 마커로 분석하였을 때 P. betulaefolia에 속하 는 2개의 유전자원 ‘OPR - 113’과 ‘OPR265’는 P. bretschneideri에 속하는 ‘Laiyangcili’, ‘Dansansuli’, ‘Xuehuali’, ‘Huangxianchangba’, ‘Qinglongtian’은 서로 다른 독립적인 그룹에 분포하여 Bao et al.(2007)의 연구결과를 확인할 수 있었다. Ⅳ 그룹에 속하는 P. communis의 경우 microsatellite 마커에 의해 동양배와 서양배를 대상으로 유전적 다양성 분석시 종에 따라 뚜렷하게 구분되 지 않음을 보고하였으나(Kimura et al. 2002), Basil and Postman(2010)은 expressed sequence tags(EST)에서 유래된 13개의 microosatellite 마커를 활용하여 81개의 P. communis, 13개 P. pyrifolia와 20개의 P. ussuriensis 또는 P. bretschneideri 에 대 한 유전적 근연 관계를 분석하였을 때 P. communis는 하나의 독립적인 품종군으로 그룹화되나 P. pyrifolia, P. ussuriensis, P. bretschneideri 동일 그룹내에서 혼재함을 보고하였다. 본 연구에서도 Basil and Postman(2010)이 활용한 마커와 다른 11개의 microsatellite 마커를 72품종 및 유전자원 분석에 활용하였을 때 P. communis에 속하는 ‘Bosc’ 외 3품종이 P. pyrifolia, P. ussuriensis, P. bretschneideri, P. betulifolia 속하는 품종과 뚜렷이 구분되어 Basil and Postman(2010)의 연구결과와 유사한 경향을 나타내었다.

본 연구에서는 최근에 보고된 배 및 사과에서 유래된 387개의 microsatellite 마커 중에서 다형성이 양호할 뿐만 아니라 반복 재현성이 우수하면서 대립유전자의 패턴이 단순한 11개를 새롭게 선발하였다. 이들 마커를 활용하여 72개 배 품종 및 유전자 원에 대하여 분석한 결과 배의 식물 분류학적 특성 및 품종 육성 계보에 따라 뚜렷하게 그룹화되는 경향을 보였다. 따라서 이 마 커를 통해 구축된 DNA 프로파일 데이터베이스는 품종간 유연관계 설정을 통한 배 유전자원 특성 평가뿐만 아니라 품종보호 품종의 대조품종 선정 등에 매우 유용하게 이용될 수 있을 것으로 판단된다. 실제로 국립종자원에서는 무(Bae et al., 2015), 호박(Sim et al., 2015) 등의 작물에서 microsatellite마커를 이용하여 작성된 품종별 데이터베이스를 활용하여 신품종 보호 제도 에 적극 활용하고 있다. 한편, 본 연구에서 새롭게 선정된 microsatellite 마커에 의해 ‘Gamcheon’과 ‘Mihwang’은 식별이 되지 않았는데, 최근 배의 경우도 SNP 마커에 대한 정보가 다수 보고되고 있는 바(Montanari et al., 2013), 이를 활용하여 정밀 분석 이 이루어져야 될 뿐만 아니라 형태적 특성을 비교 분석하여 품종 특이적인 새로운 마커 개발이 필요할 것으로 사료된다.