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고추(Capsicum annuum L.)는 우리나라에서 소비가 많은 원예작물 중 하나로 생산액의 비중이 크고 주로 양념채소로 이용된다. 그러나 고추의 생산량은 2012년에 1,041백 톤, 2013년에 1,178백 톤, 2014년에

851백 톤, 2015년에 977백 톤으로 연차간 변동이 있는 것을 볼 수 있다. 이는 중국산 고추의 수입과 국내 재배면적이 감소한 이유도 있지만 탄저병, 역병, 풋마름병 등과 같은 병해의 대발생이 원인이 되기도 한다(KSPP, 2009).

풋마름병은 세균에 의해 발병되는데 병원균이 상처 난 식물체의 뿌리를 통해 침입하여 도관을 막아 지상부로 수분공급이 되지 않아 시들어 고사하는데 지상부가 푸른 상태로 시들어 고사하기 때문에 청고병이라 불리기도 한다(Black et al., 1991). 이 병의 병원균인 Ralstonia solanacearum은 토양 속에서 장기간 월동이 가능한 토양전염성 병으로 주로 관개수를 따라 이동 전염한다(Graham and Lloyd, 1978; Graham et al., 1979; Yabuchhi et al., 1996; Han et al., 2009). 풋마름병은 열대, 아열대와 온대지역에서 광범위하게 발생하고 있지만 이 병의 병원균은 저온에 약해 온대지역보다는 열대지역에서 발병과 피해가 더 크다(Black et al., 1991). 여름철 기온이 점점 상승하고 있는 우리나라에서도 풋마름병에 대한 피해가 증가하는 추세이다. 일반 농가에서는 두둑을 높여 배수가 잘 되도록 하거나 병이 발생한 식물체를 즉시 제거하는 방법을 사용하고 있지만 현재까지 효율적인 방제법은 없는 실정이다.

풋마름병 병원체는 크게 레이스(race)와 생리형(biovar)으로 분류한다. 레이스는 기주 범위에 따른 것으로 5개의 레이스로 나뉘며, 생리형은 생화학적이나 생리학적 차이에 따른 것으로 5개의 생리형으로 나뉜다(Buddenhagen et al., 1962; Hayward, 1964). 레이스 1은 주로 생강, 담배, 감자, 토마토 등 매우 넓은 기주 범위를 가지며, 레이스 2는 바나나과, 레이스 3은 감자와 토마토, 레이스 4는 중국의 뽕나무, 레이스 5는 호주의 생강에 주로 침입한다고 보고되었다(He et al., 1983; Pegg et al., 1971). 생리형 1은 주로 미국에서 관찰되며, 아시아 국가 중에서는 필리핀에서 관찰되었다(Martine et al., 1982; Haque and Echandi, 1984). 생리형 2와 4는 전세계적으로 분포하고 있다. 생리형3은 주로 아시아에서 관찰되며, 생리형5는 중국에서만 관찰되었다고 보고되었다(He et al., 1983). Lee(1999)는 우리나라의 풋마름병 병원균은 주로 생리형 2, 3, 4가 존재하고 있다고 보고하였으며, Yun et al.(2004)은 토마토에서 71개의 풋마름병 병원균을 분리하여 생리형 검정을 수행하여 생리형 3과 4로 분류하였고, Seo et al.(2007)은 고추와 토마토에서 병원균을 분리하여 35개의 균주를 검정한 결과 모두 생리형 4로 동정하였다. Jeong et al.(2007)은 국내의 다양한 식물체에서 풋마름병 병원균을 분리하여 478개의 균주를 검정한 결과 국내에는 레이스 1과 3, 생리형 1, 2, 3, 4가 분포하고 있다고 보고하였다. 또한 Lee and Kang(2013)은 국내 주요 고추 재배지에서 분리한 63개의 풋마름병 균주를 검정한 결과 모두 레이스 1 및 생리형 3과 4로 분류하였으며, 생리형 4가 우점 계통이라 보고하였다. 이렇듯 연구시기 및 연구자에 따라 생리형에 대한 약간의 연구결과가 차이가 나타나고 있어 최근 풋마름병 병원균의 생리형에 대한 조사가 필요하다.

Lim et al.(2008)은 가지에서 풋마름병이 발생한 식물체를 수집하여 15개의 병원균을 분리하였으며, 가지, 토마토와 고추에 기주별로 접종하여 병원성을 검정하였다. 그 결과 가지와 토마토에는 병원성을 나타냈지만, 고추는 비병원성을 나타냈다고 보고하였다. 또한 Han et al.(2009)은 토마토에서 풋마름병에 저항성을 지닌 품종을 선발하기 위해 토마토 이병주에서 분리한 풋마름병 병원균을 73개의 토마토 시판품종에 저항성 검정을 실시한 결과 37개의 품종이 감수성, 24개의 품종이 중도 저항성, 12개의 품종이 저항성으로 확인되었다고 보고하였다. 이와 같이 가지와 토마토에서는 풋마름병 병원균의 병원성에 대한 연구가 보고되고 있지만 고추에서는 전혀 보고된 바가 없다.

고추에서 풋마름병을 효율적으로 방제하기 위한 가장 좋은 방법은 고추의 역병과 탄저병의 성공적인 경우(Yoon et al., 2006; Liu et al., 2014)처럼 저항성 품종을 육성하는 것이다. 풋마름병의 경우 저항성 품종 육성이 상당히 미진한 상태이다. 따라서 이 연구는 고추 풋마름병 병원균의 생리형 및 병원성을 분석하여 향후 풋마름병 저항성 품종 육성의 기초자료로서 활용하는 것을 목적으로 하였다.

재료 및 방법

식물 재료

고추 상용품종 중에서 10개를 선정하였고 대조구로서 감수성 품종과 저항성 품종을 각각 1개씩 포함하여 총 12개의 품종을 사용하였다(Table 1). 감수성 품종은 국립원예특작과학원의 의견을 참고로 하였으며, 저항성 품종은 Koh et al.(2005)를 참고로 하여 선정하였다. 저항성 품종을 플라스틱하우스 내에서 바로커 상토(서울바이오)를 충전(充塡)한 72구 트레이에 12개의 품종을 한 품종당 12립씩 파종하였고 실험은 총 3반복으로 동시에 수행하였다.

Table 1. Chili pepper materials used in this study

풋마름병 병원균 수집 및 분리

이 연구에 사용한 병원균은 2014년과 2015년 국내 고추 주산지를 기준으로 강원도와 경상남도를 제외한 6개 도 12개 시군을 선정하여 발병 증상을 보이는 식물체를 채집하여 병원균을 분리하였다(Table 2). 그 중 경북 영양에서는 파프리카, 전북 완주에서는 토마토에서도 병원균을 분리하여 총 14개의 균주를 수집하였다(Table 2). 채집한 식물체는 도관의 부패 여부를 확인한 후 세균액 분출여부(ooze test)를 통해 병원균의 감염을 확인하였다. 그 후 식물체의 이병부위를 70% 에탄올에 수초간 소독한 다음 1% 차아염소산나트륨(NaOCl)으로 5분간 표면소독을 하고 멸균수로 4회 세척한 후 물기를 제거하였다.

Table 2. Biovar classification of isolates of Ralstonia solanacearum used in this study

zSchaad et al. (2001).

페트리디쉬(10090, SPL)에 멸균수 1mL를 넣고 줄기의 이병부위를 0.5cm 간격으로 멸균된 칼로 절단하여 올려 놓았다. 일정시간이 지나면 절단된 조각에서 멸균수로 세균이 누출되는데 이를 루프(loop)로 NA 배지(nutrient agar 20g; 증류수 1L)에 도말(streaking)하여 28°C에서 48시간 배양하였다. 2일 뒤 배양된 부분을 한 번 더 NA배지에 도말하여 2일 간 배양하였다. 그 후 배양된 병원균을 TTC 배지(peptone 10g; casein hydrolysate 1g; glucose 5g; agar 17g; 증류수 1 L; 2, 3, 5-triphenyl tetrazolium chloride 1% 수용액 5 mL; Kelman, 1954)에 도말하여 28°C에서 48시간 동안 배양하였다. 풋마름병균의 형태를 보이는 콜로니(colony)를 취하여 TTC 배지에서 3회 순수분리하였다. 그 후 병원균을 Immunostrip® for Ralstonia solanacearum (Agdia)과 ELISA 방식의 Pathoscreen® kit for Ralstonia solanacearum (Agdia)을 이용하여 간이 동정을 수행하였고, 14개의 균주 모두 R. solanacearum으로 확인되었다. 순수분리된 병원균은 10% 글리세롤에 현탁하여 70°C 초저온냉장고에 보관하였다.

생리형(biovar) 검정

국내 고추 주산지에서 분리한 풋마름병 병원균은 Hayward(1964)의 방법에 따라 생리형을 조사하였다. 먼저 5가지 당(dextrose, mannitol, sorbitol, dulcitol, trehalose)의 이용 여부와 3가지 당[lactose, maltose, D(+) cellobiose]의 산화 여부를 검정하였다. 기본배지는 mineral 배지(NH₄H₂PO₄ 1.0g; KCl 0.2g; MgSO₄·7H₂O 0.2g; bacto peptone 1g; agar 3g; bromothymol blue 0.08g; 증류수 1 L; pH 7.0∼7.1)를 사용하였고 시험관에 4.5mL씩 분주한 후 각각의 당이 최종농도가 1%가 되도록 첨가하였다. TTC 배지에서 배양한 병원균을 10⁸ CFU/mL 의 농도로 20µL씩 접종하여 30°C에서 배양하며 28일 후 배지의 색이 노랗게 변하면 양성으로 판정하였다.

또한 질산염의 아질산염으로의 환원반응을 검정하였다. 아질산염 환원배지(KH₂PO₄ 0.5g; K₂HPO₄ 0.5g; MgSO₄·7H₂O 0.2g; glycerol 2.0mL; KNO₃ 3.0g; yeast extract 5.0g; agar 1.0g; 증류수 1 L; pH 6.9)를 시험관에 4mL씩 분주하여 굳히고 TTC 배지에서 배양한 병원균을 바늘에 묻혀 앞서 만든 배지에 찔러 접종(천자접종)하여 30°C에서 5일간 배양하였다. 그 후 starch iodide solution과 hydrochloric acid(HCl 16.0mL; 증류수, 84.0mL)를 만들어 각각 50µL씩 첨가하여 파란색으로 반응을 보이는 것을 양성으로 판정하였다.

마지막으로 질산염에서의 공기발생 반응을 검정하였다. 아질산염 환원 검정 방법과 마찬가지로 천자접종을 한 후 3% water agar를 3 mL씩 분주하여 봉하였다. 30°C에서 7일 동안 배양하며 매일 공기발생 여부를 조사하였고 공기가 발생하는 것을 양성으로 판정하였다. 생리형 검정을 위한 3가지 반응 실험은 14개의 균주를 한 균주당 1번씩 검정하였고 3반복으로 진행하였다.

병원성(pathogenicity) 검정

병원균을 48시간 동안 LB 액체 배지(Luria-Bertani broth 25g; 증류수 1L)에서 배양하여 10⁸ CFU/mL의 농도로 조절하여 접종원으로 사용하였다(Lin et al., 2014). 고추 품종 파종 후 본엽이 3-4매 정도가 되었을 때 지제부 부근을 멸균한 칼로 2-3회 단근 후 준비한 접종원에 침지 접종하였다. 접종 후 플라스틱하우스 내의 온도를 야간온도가 25°C 이하로 내려가지 않도록 관리하였다. 병원성 검정은 접종 28일 후에 조사하였으며 발병 정도에 따라 병세지수(disease index, DI)는 0, 1, 2, 3의 총 4단계의 기준에 의하였다(Fig. 1). 0은 병징이 보이지 않고 건전한 것; 1은 병징은 보이지 않지만 자엽이 황화된 것; 2는 줄기가 마르고 지상부가 시든 것; 3은 식물체가 완전히 고사한 것으로 판별하였다. 발병지수는 평균 0이상 1이하일 경우 저항성(resistance, R), 1초과 2이하일 경우 중도 저항성(moderate resistance, M), 2초과일 경우 감수성(susceptible, S)으로 판단하였다.

Fig. 1. Symptoms caused by Ralstonia solanacearum. A, no symptoms; B, no symptoms but cotyledon etiolated; C, most of leaves and stem wilted; D, whole plant wilted or dead.

통계분석

병원성 검정은 3반복의 실험 결과를 통계분석 SAS 프로그램(SAS 8.2, SAS Institute Inc., USA)를 이용하여 한 균주 내에서 품종 간의 병세지수 차이 유무를 one-way ANOVA(Analysis of Variation)로 분석한 뒤 Duncan's multiple range test를 이용하여 p ＜ 0.05 수준에서 유의성을 검정하였다.

결과 및 고찰

Ralstonia solanacearum 균주의 생리형 검정

국내 고추 주산지 중에서 강원도와 경상남도를 제외한 6개도의 12곳을 선정하여 풋마름병 증상을 보이는 식물체에서 풋마름병 병원균(R. solanacearum)을 분리하였고 영양과 완주에서는 고추 외에도 각각 토마토와 파프리카에서 병원균을 분리하여 총 14개의 균주를 얻었다(Table 2). 생리형 검정 결과 14개의 균주는 생리형 3과 4로 구분이 되었다. 3개 균주(AD, YYC, YYP)는 탄소원 이용능력 등 모든 생리적 검정에서 양성으로 반응이 나타나 생리형 3으로 확인되었고, 11개 균주(CJ, HS, IS, WJT, WJC, GS, SW, CY, KJ, MA, HWA)는 5가지 당의 이용과 아질산염 및 공기의 생성 여부 검정에서는 양성으로 반응이 나타났지만 3가지 당[lactose, maltose, D(+) cellobiose]의 산화 검정에서는 음성으로 반응이 나타나 생리형 4로 확인되었다(Table 2). 이와 같은 결과는 국내 풋마름병 병원균은 대부분이 생리형 3과 4에 속한다고 보고한 Lee(1999)의 결과와 일치하였다. 또한 생리형 3의 3개 균주는 모두 경상북도에서 수집한 균주이며, 생리형 4의 11개 균주는 경상북도를 제외한 5개 도(경기도, 전라남도, 전라북도, 충청남도, 충청북도)에서 수집한 균주였다(Table 2).

Ralstonia solanacearum 균주에 대한 고추 품종들의 저항성

14개 균주의 병원성 비교를 위해 감수성 품종(‘건초왕’)과 저항성 품종(‘코네시안핫’)을 포함한 총 12개의 고추 상용품종에 10⁸ CFU/mL 농도로 접종하여 Table 3과 같은 결과를 얻을 수 있었다. Table 3은 왼쪽에서 오른쪽으로 풋마름병 병원균의 병원성이 강한 순으로 나열하였고, 위쪽에서 아래쪽으로는 고추 품종의 저항성이 약한 것에서 강한 것의 순서대로 나열하였다. 이에 따라 14개의 균주와 10개의 상용품종에서 유사한 양상을 보이는 것을 묶으니 각각 크게 6개의 균주 그룹과 4개의 고추 그룹으로 구분되었다(Table 4).

Table 3. Disease index of 12 pepper cultivars inoculated with 14 Ralstonia solanacearum isolates Twelve commercial pepper cultivars were inoculated using 14 isolates at a concentration of inoculum of 108 CFU·mL-1. The experiment was conducted with 12 plants per cultivar per isolate with 3 replicates.

z0 = no symptoms; 1 = no symptoms but cotyledon etiolated; 2 = wilting observed in nearly all the leaves and stem; 3=whole plant wilted or dead. yDifferent letters indicate significant difference (p < 0.05) by Duncan's multiple range test.

균주 그룹 I에 속하는 균주는 WJT과 HWA로 감수성 품종인 ‘건초왕’을 포함한 10개의 모든 상용품종에서 강한 병원성(S, 2.5 ≤ DI ≤ 3.0)을 나타내었고 저항성 대조품종인 ‘코네시안핫’에서는 약한 병원성(M, DI = 1.2)을 보이는 것으로 나타났다(Tables 3 and 4). 균주 그룹 II는 AD, YYC, YYP 및 KJ 균주가 속하였고 ‘건초왕’과 8개의 품종에서 강한 병원성(S, 2.1 ≤ DI ≤ 3.0)을 나타내었고 ‘멋진사나이’와 ‘무한질주’에서는 약한 병원성(M, 1.2 ≤ DI ≤ 1.8)을, ‘코네시안핫’에서는 아주 약한 병원성(R, 0.6 ≤ DI ≤ 0.9)을 나타냈다(Tables 3 and 4). 균주 그룹 III에는 CJ과 HS 균주가 속하였고 ‘건초왕’과 7개 품종에서 강한 병원성(S, 2.3 ≤ DI ≤ 3.0)을 나타내었고 ‘대권선언’, ‘멋진사나이’ 및 ‘무한질주’에서는 약한 병원성(M, 1.3 ≤ DI ≤ 1.8)을 나타냈으며 ‘코네시안핫’에서는 아주 약한 병원성(R, 0.6 ≤ DI ≤ 0.9)을 나타냈다(Tables 3 and 4). 균주 그룹 IV에는 CY과 MA 균주가 속하였고 ‘건초왕’과 7개 품종에서 강한 병원성(R, 2.3 ≤ DI ≤ 3.0)을 나타냈고 ‘대권선언’과 ‘멋진사나이’에서는 약한 병원성(M, 1.3 ≤ DI ≤ 1.6)을 나타냈으며 ‘코네시안핫’과 ‘무한질주’에서는 아주 약한 병원성(R, 0.8 ≤ DI ≤ 1.0)을 나타냈다(Tables 3 and 4). 균주 그룹 V에는 GS가 속하였으며 ‘건초왕’과 7개의 품종에서 강한 병원성(S, 2.4 ≤ DI ≤ 2.8)을 나타냈고 ‘대권선언’에서는 약한 병원성(M, DI = 1.1)을 나타냈으며 ‘멋진사나이’, ‘무한질주’ 및 ‘코네시안핫’에서는 아주 약한 병원성(R, 0.5 ≤ DI ≤ 0.9)을 나타냈다(Tables 3 and 4). 마지막으로 균주 그룹 VI에는 WJC, SW 및 IS 균주가 속하였고 ‘건초왕’과 7개의 품종에서 강한 병원성(S, 2.5 ≤ DI ≤ 3.0)을 나타냈으며 ‘대권선언’, ‘멋진사나이’, ‘무한질주’ 및 ‘코네시안핫’에서는 아주 약한 병원성(R, 0.6 ≤ DI ≤ 1.0)을 나타내었다(Tables 3 and 4). 이러한 결과는 초기 유전자원 선발에 중간 정도의 병원성을 지닌 균주를 사용하는 것이 효과적이라고 보고한 Tran(2007)의 의견에 따라 고추 풋마름병 저항성 검정에 그룹 II-IV에 속한 균주들을 사용하는 것이 효율적이라는 것을 확인할 수 있었다.

이 실험에서 사용된 14개 균주에 모두 감수성을 보이는 고추 그룹 A에 속하는 품종은 ‘큰사랑’, ‘특보’, ‘PR농신’, ‘신슈퍼엄청나’, ‘PR진대건’, ‘먹고또먹고’ 및 ‘두루두루’였다(Table 4). 그룹 B는 ‘대권선언’이, 그룹 C는 ‘멋진사나이’가, 그룹 D는 ‘무한질주’가 속하는데, 일부 균주에 대해 중도 저항성(M) 및 저항성(R)을 가진 것으로 보였다(Table 4). 저항성 대조구로 사용한 ‘코네시안핫’은 균주 그룹 I에 속한 균주에 대해서만 중도 저항성(M)을 보였고 나머지 균주에 대해서는 저항성(R)을 보였다(Table 4). 특히 ‘무한질주’, ‘멋진사나이’ 및 ‘대권선언’은 풋마름병에 저항성이 있다고 표시하여 판매되고 있는 품종들로 이 실험에서 나타난 결과와 일치하는 것을 확인할 수 있었다(Tables 1 and 4). 그 중 ‘무한질주’는 역병과 풋마름병에 저항성을 지닌 복합내병성 품종이나 이 실험의 결과는 풋마름병에 대한 저항성 정도가 ‘코네시안핫’만큼 강하지 않은 것을 확인할 수 있었다(Table 4). 따라서 앞으로 ‘코네시안핫’만큼 강한 풋마름병 저항성 품종을 육성해야 할 것으로 판단된다.

또한 Table 4의 결과에 따르면 풋마름병 저항성이 하나 또는 소수의 유전자가 관여하는 질적 저항성이 아닌 다수의 유전자가 관여하는 양적 저항성임을 예상할 수 있다. Mimura et al.(2009a, 2009b)은 말레이시아 고추 유전자원 LS2341을 풋마름병 저항성 유전자원으로 선발한 다음, ‘California Wonder’(이병성)와 교배한 후대에서 배가반수체(DH) 집단을 만들어 양적형질유전자좌(QTL) 분석을 수행하여 하나의 주동 QTL을 탐색하였다. Bw1이라고 명명된 이 QTL은 LS2341에서 유래하였고 풋마름병 저항성을 33% 설명할 수 있었다. 또한 이 QTL과 연관된 CAMS451 분자표지를 개발하였으며 개발된 분자표지는 풋마름병 저항성 품종 육성 시 이용될 수 있을 것이라고 보고하였다(Mimura et al., 2009a). 이와 마찬가지로 이 연구에서는 ‘코네시안핫’이 국내 여러 풋마름병 병원균에 대해 전반적으로 강한 저항성을 보이는 것으로 보아 ‘코네시안핫’을 저항성 유전자원으로 사용하여 QTL 분석을 수행할 필요가 있어 보인다.

Table 4. Interaction between chili pepper cultivars and Ralstonia solanacearum isolates

zzI, WJT, HWA; II, AD, YYC, YYP, KJ; III, CJ, HS; IV, CY, MA; V, GS; VI, WJC, SW, IS. yR, resistant, disease index ≤ 1; M, moderate resistant, 1 < disease index ≤ 2; S, susceptible, disease index >2. xKeunsarang, Teukbo, PR Nongshin, Shin Super Eomcheongna, PR Jindaegeon, Meokgottomeokgo, Duruduru.

이 연구는 풋마름병에 저항성인 품종을 육성하는 데 있어 국내에 어떤 생리형이 존재하는지에 대한 정보를 제공하고 있고, 또한 풋마름병 저항성 고추 육종에 이용할 수 있는 유전자원을 선발하는 방법에 대한 기초 정보를 제공하고 있어 이 연구의 결과는 앞으로 풋마름병 저항성 품종 육종이나 고추 대목품종 육종(Abebe et al., 2016) 등에 크게 기여할 수 있을 것이라고 기대된다.