서 언

Rocket salad(Eruca sativa)는 지중해가 원산지이며 배추과(Brassicaceae) 채소에 속한다. 이탈리아에서는 ‘rucola’, 독일에서 는 ‘ackerrauke’, 일본에서는 ‘kibanasuzushiro’로 알려져 있다(Kim et al., 2006). 또한 rocket salad의 잎은 고추냉이처럼 맵고 알싸한 맛과 향이 나는데 보통 샐러드로 이용되며, 이탈리아에서는 스파게티, 파스타, 피자 등에 사용되고 있다(Jirovertz et al., 2002). 특히 매운 맛은 rocket salad의 glucosinolates(GSLs)와 그 분해산물인 4-mercaptobutyl isothiocyanate(ITC)와 관련이 깊으며 항발암성, 항균, 항박테리아 효과가 있다(Fenwick et al., 1983). 이외에도 비료 3요소(N, P, K) 양액 처리에 따른 rocket salad 내 총 GSLs 함량이 N의 비율이 낮을수록 높아지고, P의 비율이 높을수록 높아지며, K의 비율에 따라 총 GSLs 함량 변화 는 뚜렷한 경향을 나타내지 않은 것으로 보고되었다C(hun et al., 2015).

GSLs는 황과 질소를 함유하고 있는 배추과 식물의 2차 대사산물이다. GSLs는 아미노산으로부터 생합성되고 aliphatic, indolyl, aromatic GSLs로 구분된다(Fahey et al., 2001). GSLs는 myrosinase에 의해 가수분해되어 각각 isothiocyanate, nitrile, thiocyanate와 glucose로 전환된다(Fenwick et al., 1983). 특히 isothiocyanates는 종양을 저해하는 성질을 가지고 있으며 간암, 위암, 폐암 등에 효과가 있을 뿐만 생체방어반응에 관여 한다(Zhang and Talalay, 1994; Talalay and Zhang, 1996). 현재까지 연 구 결과에 의하면 rocket salad에는 7종류(glucoraphanin, sinigrin, diglucothiobeinin, glucoerucin, glucobrassicin, dimeric 4-mercaptobutyl-GSL, 4-methoxyglucobrassicin)의 GSLs가 존재하는 것으로 보고되어 있다(Kim et al., 2007).

재배환경 요소 중 하나인 광은 식물의 생장 및 2차 대사산물 합성에 관여한다(Lee et al., 2014). 작물 재배 연구에 주로 이용 되는 메탈할라이드 램프는 발광효율이 낮고 수명이 짧으며, 형광등은 발광효율이 20% 수준으로 광합성에 유효한 스펙트럼이 적다(Park et al., 2012). 이러한 문제를 보완하기 위해 개발된 발광 다이오드(Light Emitting Diode, LED)는 수명이 길고 전력 소모량이 적어 경제적이다(Hwang et al., 2004). 특히 적색 LED는 광합성에서 엽록소가 흡수하는 파장인 660nm에 가까워 식 물 생장에 필수적이며 케일에 적색 LED를 조사하였을 때 GSLs 함량이 증가하는 것으로 보고되어 있다(Lefsrud et al., 2008; Massa et al., 2008). 최근에는 LED와 작물을 이용해 단색광을 주는 것만이 아닌 red, blue LED을 적절히 혼합하여 사용한다. 고추냉이(Wasabia japonica)의 경우 red LED와 blue LED을 단일 파장으로 처리했을 때보다 R+B(Red+Blue)을 처리한 고추 냉이의 생물체량이 각각 약 1.6, 3.2배 높았다(Kim et al., 2013). 자외선(Ultra-violet, UV)은 파장에 따라 UV-A(320-400nm), UV-B(280-320nm), UV-C(200-280nm)로 나눠진다(Schenk et al., 2011). 그 중 UV-C는 광화학 반응을 일으켜 식물체 DNA 손상을 가한다고 알려져 있다(Danon and Gallois, 1998). 낮은 수준의 UV-C 조사는 페놀 화합물, 폴리아민 등 다양한 2 차 대사산물의 생성을 유발시키고, 이러한 2차 대사산물은 항균 활성을 가지거나 작물의 품질에 영향을 끼친다(Jansen et al., 2008). 수확 후 단감(Diospyros kaki cv. Fuyu)에 UV-C를 2분간 조사하였을 때 착색이 증진되고 2차 대사산물 중 하나인 carotenoid 함량이 증가하였다(Choi, 2011).

현재까지 LED 조사가 식물체의 생장이나 대사물질(베타 카로틴, 전분 등) 함량에 미치는 실험 결과는 많이 보고되었지만 (Wu et al., 2007; Wang et al., 2009), 다양한 LED광원뿐만 아니라 자연광(온실재배)과 비교하여 식물체 내 GSL 함량을 분석 한 결과는 거의 없다. 또한 UV-C는 수확 후 과채류 표면의 미생물 오염 방지에 관한 연구에 집중되었다. 따라서 본 실험에서 는 rocket salad의 GSL 생합성 과정에 영향을 끼치는 인공광원[Red LED, Blue LED, Mix (Red+Blue) LED, White LED, Fluorescent Lamp] 및 UV-C를 조사하여 식물체 생장과 체내에 축적된G SL 함량을 조사하였다

재료 및 방법

용매

Acetonitrile(CH₃CN)과 methanol(CH₃OH)은 J.T Baker Chemical Co.(Phillipsburg, NJ, USA)것을 구입하였다. Sodium acetate(NaC₂H₃O₂·3H₂O)은 Samchun Pure Chemical Co., Ltd.(Pyeongtaek, Korea)것을 사용하였다. 컬럼 충진물인 DEAESephadex A-25는 GE Healthcare Bio-Sciences AB(Uppsala, Sweden), sinigrin(2-propenyl GSL)과 aryl sulfatase(type H-1, EC 3.1.6.1)는 Sigma-Aldrich Chemical Co.(St Louis, MO, USA) 제품을 사용하였다.

시료 채취 및 재배 환경

2015년 2월 20일, rocket salad ‘ODYSSEY’(Sakata Seed Company, Yokohama, Japan) 종자를 충남대학교 농업생명과학대 학 유리온실에서 플러그 트레이(plug tray 72 홀)에 원예 상토를 넣고 1차(실험 I), 2월 25일에는 2차(실험 II) 파종(0 DAS, days after sowing, 파종 후 경과 일수)하였다. 본 광원 조사 실험은 6종류의 인공광원을 조사하기 위한 식물생장기 대수의 제한 때문 에 [실험 I]과 [실험 II]로 구분하여 수행하였다. Rocket salad 종자는 충남대학교 농업생명과학대학 유리온실에서 플러그 트레 이(plug tray 72 홀)에 원예용 상토(high, Punong bed soil, Gyeongju, Korea)를 채운 후 물을 뿌리고 난 다음 작은 홈을 파고 파 종한 후 다시 상토로 가볍게 덮어주고 손가락으로 눌러 주었다. 햇볕을 차단하고, 수분의 증발을 막기 위하여 신문지로 덮고 그 늘진 곳에 놓고 싹을 틔운 다음 이틀 후에 신문지를 걷어내고, 트레이는 햇빛이 잘 비치는 곳으로 옮겨두었다. 관수는 파종 후 이식 전(21 DAS)까지 이틀에 한 번 지하수를 주며 재배하였다. 유묘 이식은 22 DAS(실험 I, 3월 13일; 실험 II, 3월 18일)에 50 유묘 중 12 유묘를 선별하여 포트(14.5 × 14.5 × 16cm³)에 같은 상토를 넣고 이식하였다. 이식한 포트(14.5 × 14.5 × 16cm3) 는 햇빛이 잘 비치는 곳에 두었다. 유리온실 내 온도가 28ºC 이상이면 포트를 바람이 통하고 선선한 외부로 옮겨두고 저녁에는 다시 유리온실에 넣어 두어 재배하였다. 온실 재배(0-41DAS) 동안 식물체 포트는 무작위적으로 배치하여 관수를 할 때 마다 시계 방향으로 이동 시켜서 재배 환경을 동일하게 하였다

실험에 사용된 광원은 자연광(Control-1 또는 2), Red LED(640nm), Blue LED(430nm), Mix(R+B) LED(Red LED+Blue LED), White LED, Fluorescent Lamp(FL), Fluorescent Lamp+UV-C(FL+UV-C) 7종류이었다. 41 DAS(실험 I, 4월 1일; 실 험 II, 4월 5일)에 자연광(Control-1 또는 2) 실험용 식물체는 계속해서 유리온실에서 재배하고, 인공광원 실험용 식물체는 식 물생장환경조절장치(growth chamber)로 포트 채 옮겨 Red LED, Blue LED, Mix(R+B) LED(실험 I), White LED, FL, FL+UV-C(실험 II)를 5일(41-46 DAS) 동안 조사하고, 지상부만을 46 DAS에 수확하였다. ‘Mix(R+B) LED’의 혼합 비율은 Red: Blue=7: 3이었다. 식물생장환경조절장치 내부 환경은 모든 광원에서 온도 24/15ºC, 습도 55%, 광주기(명기/암기; 16/8 h)로 처리하였다. 처리 광량은 모든 실험구에서 동일하게 180μmol/m2·s로 조절하였고, LED광은 식물체 상부에서, FL과 UV-C는 측면에서 조사하였다. 또한, UV-C는 5일 동안 암조건 상태일 때, 2분간 조사하였다. 각 광원의 광량이 식물체에 균 등하게 조사되도록 포트를 하루에 한 번씩 시계방향으로 이동시켜 주었다. 수확한 직후 잎의 생체중(fresh weight)과 길이를 측 정한 후 3차 증류수 순으로 깨끗이 씻고 수분을 제거하여 알루미늄 호일로 포장한 후 -70ºC 급속 초저온 냉동고에 보관하여 동 결 건조한 후에 막자와 막자사발로 분말화 하였다

GSL 추출

건조한 분말 시료 100 mg을 칭량하여 2.0mL-Eppendorf tube에 넣고 70%(v/v) boiling methanol(1.5mL)을 넣고 진동혼합 (vortex) 하였다. 그 후 항온수조(70ºC)에서 5분간 조(crude) GSLs를 추출하고, 원심분리(12,000rpm, 10min, 4ºC)한 후에 상층 액은 시험관에 수거하였다. 동일한 과정으로 2번 더 반복한 후 각 상층액을 합하였다

Mini-column 충진용 DEAE Sephadex A-25는 3차 초순수에 녹여 분액여두에 넣은 다음 3차 초순수가 거의 빠져나간 다 음에 sodium acetate(0.5 M)로 H+ 형태로 활성화 시켰다. 출구를 탈지면으로 막은 mini-column(1,000μL pipet tip)에 활성화 된 DEAE Sephadex A-25를 넣은 후 GSL 조추출물을 기포가 생기지 않게 주의하며 pasteur pipet으로 로딩 하였다. 추출물이 다 빠지면 3차 초순수 2mL를 로딩 하여 mini-column에 남아있는 불순물을 제거하였다. 3차 초순수가 다 빠져나가면 파라핀필름(paraffin film)으로 컬럼 아래 부분을 막고 aryl sulfatase solution 75μL을 넣고, mini-column 위 부분을 파라핀 필름으로 막고 16-18시간 동안 상온에서 정치하였다. 다음 날 2.0mL-Eppendorf tube에 3차 초순수(0.5mL × 3회)로 desulfo(DS)- glucosinolate를 용출시켰다. 용출시킨 시료는 0.45μm hydrophilic PTFE syringe filter(직경 13mm)로 필터한 후, HPLC용 vial 병에 넣어 냉장 보관하였다

GSL 추출

GSL 분석은 Inertsil ODS-3 column(150 x 3.0mm I.d., particle size 3μm)과 가드 컬럼은 Inertsil ODS-2 cartridge Guard column E(10 x 2.0mm I.d., particle size 5μm)(GL Science, Tokyo, Japan)을 장착한 HPLC system(Agilent Technologies 1200 series, CA, USA)를 사용하였다. 검출 파장(detection wavelength)은 227nm, 컬럼 온도는 40ºC, 유량(flow rate)은 0.4 mL·min로 설 정하였다. 시료는 자동주입기(automatic injector)를 사용하여 10.0μL 주입하였다. 이동상 용액은 용매 A(3차 초순수)와 용매 B(acetonitrile, CH₃CN)를 사용하였다. 용매 B는 첫 시작부터 2분까지는 0%로 유지시키고 7분까지 0%에서 10%로 증가시키 고, 16분까지는 10%에서 31%로 증가시켰다. 19분까지는 31%를 유지시키고 21분까지 31%에서 0%로 감소, 27분까지 0%를 유지시켰다. 각 GSL 성분은 외부표준물질인 sinigrin의 HPLC 피크 면적과 각 성분의 면적을 비교하여 그 값에 response factor 를 곱하여 정량화(μmol·g^-1DW)하였다.

LC-ESI-MS 분석에 의한 DS-GSL 동정

각 DS-GSLs 성분은 4000 QTrap LC-ESI-MS/MS system(Applied Biosystems Instrument)를 사용하였으며, 분석 컬럼 은 Inertsil ODS-3 column(150 x 3.0mm I.d., particle size 3μm)을 사용하였다. 가드 컬럼은 Inertsil ODS-2 cartridge Guard column E(10 x 2.0mm I.D., particle size 5μm)(GL Science, Tokyo, Japan)를 사용하였다. 스캔시간(scan time)은 1.0s, 컬럼 온 도는 40ºC로 설정하였다. 스캔범위(scan spectra)는 m/z 100-1,000, 검출 파장(detection wavelength)은 227nm, 유량(flow rate)은 0.4mL·min-1로 설정하였다. 시료는 자동 시료주입기(automatic injector)를 사용하여 10.0μL 주입하였다

통계분석

HPLC 분석 결과는 Microsoft Office Excel 2010을 이용하여 각 성분에 대한 함량의 평균값과 3반복의 표준편차를 구하였 다. 통계처리 프로그램은 Windows용 IBM SPSS 21 Statistics을 사용하였다. 유의수준은 0.05 이하로 설정하였고, Tukey 검정 을 시행하여 유의성을 검증하였다.

결과 및 고찰

[실험 I] ‘Red LED’, ‘Blue LED’, ‘Mix LED’의 조사에 따른 생장 효과

광원[Control-1, Red LED, Blue LED, Mix(R+B) LED]이 다른 광질을 5일간 처리 하에서 식물체 길이는 ‘Red LED’(62.21) 에서 증가율이 가장 높았고, ‘Mix(R+B) LED’(24.76%)에서 증가율이 가장 낮았다(Table 1). 생체중은 ‘Red LED’(15.72)와 ‘Blue LED’(15.94 g)가 높았으며 두 처리구는 큰 차이를 보이지 않았다. 수분함량은 ‘Red LED’(93.0) > ‘Blue LED’(92.92) > ‘Control-1’(92.53) > ‘Mix(R+B) LED’(90.78%) 순으로 감소했다. ‘Red LED’의 수용체인 피토크롬(phytochrome)은 식물의 발아, 묘종의 발달과 개화까지 식물의 다양한 생리학적 반응에 관여하고(Botto et al., 1996), ‘Blue LED’는 상추의 잎 두께 촉진 (Johkan et al., 2010)등 잎의 기능과 관련있다. 따라서 식물체에 조사된 광질과 이들을 흡수하는 광수용체의 종류에 따라 작물의 생장반응이 다르게 나타난다(Lee and Kim, 2014). 상기와 같이 ‘Red LED’와 ‘Blue LED’ 조사는 식물체의 발아, 잎 두께, 개 화 등 작물의 생리적 영향을 주었지만, 본 실험에서는R ‘ed LED’와 ‘Blue LED’ 간 유의적인 생육 차이는 없었다

Table 1. Plant growth (n=3) of rocket salad grown with different lightsf or five days

zControl-1 or 2, grown in the greenhouse. yMix (R+B) LED, Red + Blue (R:B=7:3). xFL, Fluorescent Lamp. wWithin each column, values follow by the same letters are not sginificantly different atp ≤ 0.05, using Tukey’s multiple-range test. Mean ± standard deviation

[실험 II] ‘White LED’, ‘FL’, ‘FL+UV-C’의 조사에 따른 생장 효과

광원(Control-2, White LED, FL, FL+UV-C)이 다른 광질을 5일간 처리 하에서 식물체 길이는 ‘FL’(61.07)에서 가장 높은 증가율을 보였으며, ‘White LED’(48.31%)에서 가장 낮은 증가율을 보였다(Table 1). 생체중은 ‘FL’(26.77)에서 가장 높았으며 ‘White LED’(15.05 g)에서 가장 낮았다. 형광등 조사는 LED 광원에 비해 광파장 대역이 다양하기 때문에 작물의 생육에 좋다 고 보고되었다(Park et al., 2012). 수분함량은 ‘White LED’(92.15) > ‘FL’(91.16) > ‘FL+UV-C’(90.85) > ‘Control-2’(90.82%) 순으로 감소했다. 인공광원에 따른 rocket salad의 생장은 집단 간의 차이는 있었으나 통계학적 유의성은 거의 나타나지 않았 다(p < 0.05).

GSL 분리 및 동정

Rocket salad 내 GSLs를 HPLC와 LC-ESI-MS로 분석한 결과, 기존의 발표된 rocket salad의 GSLs는 glucoraphanin, sinigrin, diglucothiobeinin, glucoerucin, glucobrassicin, dimeric 4-mercaptobutyl-GSL, 4-methoxyglucobrassicin로 보고 되었지만(Kim et al., 2007), 본 실험에서는 7종류의 GSLs(glucoraphanin, diglucothiobeinin, glucoerucin, glucobrassicin, dimeric 4-mercaptobutyl GSL, 4-methoxy glucobrassicin, gluconasturtiin)를 분리 및 동정하였다(Table 2, Fig. 1. and Fig. 2.).

Table 2. Glucosinolates identified using LC-ESI-MS in rocket salad

zNo., the elution order in HPLC analysis. yRT, retention time (min). xAs a desulfo-glucosinolate. wThe international organization for standardization (ISO 9167-11992). *Undecided by the ISO. vAccording to Clarke (2010).

Table 3. Glucosinolate contents (μmol/g dry wt.) in rocket salad grown with different lights for five days

zNo., the elution order of glucosinolate yRT, retention time (min). xND, not detected wWithin each column, values follow by the same letters are not sginificantly different atp <0.05, using Tukey’s multiple-range test (n=3). Mean ± standard deviation.

Table 4. Individual glucosinolate proportions (%) of the total glucosinolate content in rocket salad grown with different lights for fvie days

zND, not detected

[실험 I] ‘Red LED’, ‘Blue LED’, ‘Mix LED’의 조사에 따른 GSL 함량

광원[Control-1, Red LED, Blue LED, Mix(R+B) LED]이 다른 광질을 5일간 처리 하에서 각 GSL 성분 별 함량 범위는 glucoraphanin(0.10), diglucothiobeinin(0.11), glucoerucin(0.22), glucobrassicin(0.06), dimeric 4-mercaptobutyl GSL(0.03-3.40), 4-methoxy glucobrassicin(0.10-0.29), gluconasturtiin(0.11μmol·g^-1 DW)으로 나타났다(Table 3). Kale sprouts 재배 시 ‘LED’와 ‘Far-red’에 따른 총 aliphatic GSL 함량을 조사한 결과, ‘Far-red’(3.50) > ‘Blue LED’(2.94) > ‘Dark’(2.80) > ‘Red LED’(2.64) > ‘White LED’(2.48μmol·g-1 DW) 순으로 감소했다(Carvalho and Folta, 2014). 그러나 본 실험에서 총G SL 함량은 ‘Control-1’(0.20)과 비교하였을 때, ‘Red LED’(4.30)에서는 약 21.4배 높았고, ‘Blue LED’(0.17)과 ‘Mix(R+B) LED’(0.21μmol·g^-1 DW)에서는 약간 감소하거나 같았다. 현재까지 연구결과에 의하면 ‘Red LED’는 콩의 묘에서 베타 카로틴 및 항산화도를 증가시킨다고 보고했다(Wu et al., 2007). 본 실험도 ‘Red LED’ 조사에 따라 ‘Control-1’에서는 검출되지 않았 던 glucoraphanin, diglucothiobeinin, glucoercin, gluconasturtiin이 증가하였다. ‘Red LED’의 총 GSL 함량 중 가장 높은 비율 을 나타낸 성분은 dimeric 4-mercaptobutyl GSL으로 전체의 79%를 차지하였으며, 4-methoxy glucobrassicin 이 6%로 그 다 음으로 높은 비율을 차지하였다(Table 4). 따라서 [실험 I]을 비교 분석해 본 결과, ‘Red LED’에서 재배한 rocket salad가 기능적 으로 가치가 높을 것으로 판단된다.

판별분석을 통한 야간 조사 처리의 영향 분석

무처리구와 야간 조사 처리구 전체를 비교하였을 때 anthocyanin 함량과 chlorophyll a 함량을 기준으로 구분이 가능한 것으 로 분석되었다(Table 4). 이는 야간 조사 처리는 과실의 착색 지연에 가장 큰 영향을 미친다는 것을 의미한다. 각각의 야간 조사 처리구와 무처리구를 비교한 결과 각 처리마다 다른 구분 기준들이 도출되었다. 적색광 처리는 과실의 내적 품질 및 과방중에 영향을 미쳐 당도와 과방중을 기준으로 적색광 처리 과실과 무처리 과실과 구분되었다. 청색광 처리 과실은 과실의 품질 및 착 색에 영향을 미쳐 당산비와 anthocyanin 및 chlorophyll a 함량을 기준으로 청색광 처리 과실과 무처리 과실의 구분이 가능하 였다. 마지막으로 백색광 처리는 chlorophyll a의 감소를 억제하여 chlorophyll a를 기준으로 백색광 처리 과실과 무처리 과실 의 구분이 가능한 것으로 조사되었다.

본 연구에서 야간 조사는 청색광 처리구의 일부 과실에서 보여진 과실 비대에 긍정적인 영향을 제외하면 과실의 낮은 가용 성 고형물 함량과 높은 산도 및 착색 지연, 충해 과실 발생 등의 부정적인 영향들을 야기하였다. 본 연구에서 보여진 야간 조사 로 인한 변화를 ‘빛공해’의 관점에서 보면, 크게 생리적 또는 직접적 빛공해와 물리적 또는 간접적 빛공해로 나누어 볼 수 있었 다. 먼저 당 및 anthocyanin 축적의 지연, 산 및 chlorophyll 감소의 억제와 같이 야간 조사가 과실의 생리적 반응 및 변화들에 미치는 영향은 야간조사에 따른 생리적 또는 직접적 빛공해로 구분할 수 있으며, 인공 광원이 존재함으로 인해 광원 주변으로 벌 레들을 집중되고 이로 인한 충해과의 발생은 야간 조사에 따른 물리적 또는 간접적 빛공해로 구분할 수 있다. 야간 조사에 따른 빛공해의 양상은 처리구에 따라 다소 다른 결과를 보이는 것으로 조사되었다. 먼저 적색등, 청색등, 백색등 처리구 모두 무처리 구에 비해 당도 및 anthocyanin 함량이 낮고 chlorophyll a 함량이 높아 모든 처리구에 걸쳐 생리적 빛공해가 발생하였으며, 그 중, 청색광 처리는 다른 처리구에 비해 산도가 가장 높고 당산비는 가장 낮아 청색광 처리구의 생리적 빛공해가 가장 심한 것으 로 판단되었다. 반면에 적색광 처리구의 경우에는 과방중이 낮았으며 이는 충해과의 발생으로 인한 것으로 추정되어 물리적인빛공해는 적색광 처리구가 가장 심한 것으로 판단되었다 .

Table 3. Comparison of fruit pigments at each harvest time according ton ight lighting in ‘Kyoho’ Grapess

zDays after full bloom. yMean separation within each column according to Duncan’s multiple range test, 5% level.

Table 4. Models for discriminant of night lighting treated grape. Models were derived by stepwise multivariable discriminant analysis. Letters in parentheses indicates orders of variables that were inputted in each function.

zAll values of red, blue, and white lamp treatments were entered into the discriminant analysis.