서 언
재료 및 방법
실험 재료
단백질 추출 및 이차원 전기영동
MALDI-TOF/TOF MS의 분석
결과 및 고찰
단백질체의 전개 및 번호의 부여
과피 및 과육에서 발현량의 차이가 나는 단백질체의 동정
서 언
중앙 아시아의 Malus sieversii로부터 유래된 사과(Malus domestica Borkh.)는 오늘날 전세계에서 널리 재배되고 있는 목본류의 과일로, 그 특성과 품종이 매우 다양하다(Elzebroek and Wind, 2008; Christopher et al., 2009). ‘Golden Delicious’ 품종의 염기서열 분석을 통하여 사과의 유전체에는 약 57,000여개의 유전자가 존재하는 것으로 예상되었으며, 지금까지 보고된 식물 중 그 수가 가장 많은 것으로 알려져 있다(Velasco et al., 2010).
단백질체는 특정 조건에서 생물체의 유전체로부터 발현되는 단백질 전체를 의미하는데, 생물체의 유전체 자체는 변하지 않지만 단백질체의 발현은 세포, 소기관, 조직, 시간, 미세 및 거시 환경 등과 같은 다양한 조건에 의해 조절된다(Holman et al., 2013). 사과와 관련된 체계적인 단백질체 연구는 이탈리아 남부 지역의 Annurca 사과의 3계통에서 실시되었는데, 각 계통의 과일에서 203개의 단백질 spot이 공통적으로 발현되었으며, 그 중의 대표적인 39개는 대사, 에너지, 스트레스, 과실의 성숙 및 알레르기 등의 기능과 관련된 것으로 밝혀졌다(Guarino et al., 2007). 한편 사과의 미토콘드리아에서 단백질의 발현을 분석한 결과 성숙과 관련하여 carbonyl화된 산화 단백질 및 Mn-SOD의 발현이 증가하였으며, 이는 활성산소종의 생성과 소거가 과실의 성숙에 관여한다는 것을 시사하였다(Qin et al., 2009). 저장성이 다른 사과 품종들의 과실 프로테옴을 분석·비교한 결과, 높은 저장성을 갖는 품종에서는 에틸렌 생합성 관련 단백질의 발현량이 적고 세포 골격의 형성과 관련된 단백질들의 발현량은 더 높았다(Marondedze and Thomas, 2012). 또한 해독 및 방어에 관여하는 다수의 단백질들은 과일의 성숙과 더불어 발현량이 증가하였다. 사과 과실은 에틸렌 생합성을 억제하면 성숙 및 노화가 지연되는 것으로 알려져 있는데(Fan et al., 1999), 사과 과실 성숙의 각기 다른 단계에서 에틸렌을 처리한 후 단백질체의 변화를 조사한 결과, 성숙이 진행될수록 에틸렌 생산, 항산화 및 산화 환원, 탄수화물 대사, 산화적 스트레스, 에너지 및 방어 반응과 관련된 많은 단백질들의 발현량이 증가하였다(Zheng et al., 2013).
사과는 식이 섬유나 항산화 물질이 풍부하고, 심장병, 뇌졸중 및 일부 암과 같은 만성 질환의 진행이나 발생을 억제함으로써 인류 건강에 기여하는 식품으로 알려져 있다(Boyer and Liu, 2004; Ribeiro et al., 2014). 그러나 사과에는 자작나무 꽃가루 알레르기 항원인 Bet v 1과 상동성인 17.5kDa의 Mal d 1(pathogenesis-related protein; PRP-10), 23kDa의 thaumatin-like protein(TLP)인 Mal d 2(PRP-5), 9kDa의 lipid transfer protein(LTP)인 Mal d 3(PRP-14) 및 14kDa의 Bet v 2와 상동성인 Mal d 4(profilin)와 같은 주요 알레르기원들이 있으므로 민감한 사람에게 알레르기를 초래할 수도 있다(Herndl et al., 2007). 사과 단백질체의 분석 결과 경미한 증상을 유발하는 Mal d 1은 주로 과육에 함유되어 있으나, 비특이적 지질 단백질인 Mal d 3는 과피에 함유되어 있는 것으로 보고되었다(Marzban et al., 2005). 장기간 저장된 사과에서 Mal d 1은 증가하였으나(Sancho et al., 2006b), Mal d 3는 감소하였다(Sancho et al., 2006a). 또한 western blot의 결과 사과의 수용성 분획 중의 단백질에서 Mal d 1, Mal d 2, Mal d 3 및 Mal d 4가 존재하는 것이 밝혀졌다(Herndl et al., 2007).
사과와 같은 다육질의 과실은 건조 방지, 병균의 침입이나 해충에 의한 섭식 예방, 균열 방지 등과 같은 원예학적으로 중요한 특성에 대한 기여를 하는 소수성의 큐티클 층에 쌓여 있다. 과실의 큐티클 층은 잎과 같은 영양 기관의 큐티클 층과 공통점이 많지만, 기공이 없고 잎의 큐티클 층보다 두꺼우며, 상대적으로 쉽게 분리 될 수 있다(Martin and Rose, 2014). 큐티클 층은 큐틴 중합체(Kolattukudy, 2001)와 왁스로 구성되어 있다(Jetter et al., 2006). 큐틴은 표피세포가 생성하는 지방으로 만들어진 큰 분자량의 불용성 물질이나 그 자체는 우수한 방수성 물질이 아니기 때문에 같은 표피세포에서 생성된 왁스가 큐틴층의 외부를 감싸고 내부에도 침적되어 고도의 불투수층을 만든다. 사과 과일의 큐티클 층에는 또한 다양한 종류의 phytochemical도 함유되어 있다. Phytochemical은 일반적으로 카로티노이드 및 폴리페놀을 포함하며, 사과의 경우 과피와 같이 색깔이 있는 부분에 집중되어 있다. 카로티노이드는 광합성을 위한 광 에너지의 흡수와 과잉의 여기된 삼중항 엽록소 및 일중항산소를 소거하는 주요한 역할(Armstrong and Hearst, 1996) 외에 착색(Vershinin, 2008) 및 신호 전달(Finkelstein, 2013)에도 관여한다. 착색과 관련하여 카로티노이드는 400–550nm의 파장을 갖는 빛을 흡수하므로 짙은 노란색과 주황색을 띄며(Archetti et al., 2009), 수확기가 되면 다량으로 생성되는 폴리페놀 계열의 안토시아닌에 의해 빨강과 자주색 등이 발현된다(Davies, 2004). 폴리페놀은 다수의 페놀 구조 단위를 갖는 수용성 화합물로 식물 조직에서 옥신과 같은 성장 호르몬의 방출 및 억제의 조절, UV에 대한 보호작용, 섭식의 억제, 미생물의 감염 예방, 성숙 및 기타 성장 과정에서 신호 분자 등과 같은 다양한 기능을 수행하는 것으로 알려져 있다(Lattanzio et al., 2006; Quideau et al., 2011).
본 연구의 저자들은 이전 연구에서 2-DE 및 matrix assisted laser desorption/ionization-time of flight/ time of flight mass (MALDI-TOF/TOF MS) 분석을 이용하여 사과 ‘홍로’ 품종의 과피에서 발현되는 단백질체의 전체상을 파악하기 위한 연구를 수행하였다. 그 결과 pI 4-8의 범위에서 발현되는 502개의 단백질 spot을 분리하였고, 그 중에서 각각의 생리적인 기능을 갖는 413개의 단백질들을 동정하였다(Kim et al., 2020). 현재까지 사과와 관련되어 보고된 대부분의 단백질체 연구들은 주로 과육을 중심으로 이루어져 왔으며, 과피 및 과육에서 발현되는 단백질체의 차이와 관련된 연구들은 거의 없다. 사과의 경우 생식으로 소비되는 부위는 주로 과육이며 과피는 대부분 버려진다. 사과의 과피는 불투수층인 큐티클층으로 쌓여 있으며, 다양한 생리·생화학적 작용과 색깔을 나타내고 항산화 및 항암성과 같은 유용한 작용을 하는 phytochemical이 다량 함유되어 있으므로 단백질체의 발현 양상이 과육과는 다를 것으로 예상되었다. 따라서 본 연구에서는 사과 ‘홍로’ 품종의 과피와 과육에서 발현되는 단백질체를 비교·분석하여, 과피와 과육의 생리 및 생화학적 특성의 차이와 관련된 단백질체의 전체 상을 파악하고자 하였다. 상기 연구의 성과들은 사과의 재배 생리, 육종, 저장, 품질, 환경에 대한 내성 등과 관련된 광범위한 연구에 유용하게 이용될 수 있을 것으로 사료된다.
재료 및 방법
실험 재료
2014년 8월 26일 경남농업기술원 사과이용연구소에서 적정의 수확기에 이른 ‘홍로’ 품종의 과실을 1반복당 9개(3개/1주당)씩 3반복으로 수확하였다. 사과는 수확 당일에 수도물로 세정한 후 과피 박리용 칼로 두께가 1mm 이하가 되도록 유의하며 과피를 과육으로부터 박리하였다. 박리된 과피 및 과육은 유발에서 즉시 액체질소로 동결한 후 마쇄하여 –70°C에 보관하고, 이후의 단백질추출에 사용하였다.
단백질 추출 및 이차원 전기영동
단백질은 수정된 페놀법으로 추출되었다(Hurkman and Tanaka, 1986). 초저온에 보관되어 있던 과피 및 과육의 분쇄물을 적당량 분주한 후 ice-cold extraction buffer(EB)를 첨가하여 단백질을 추출하였다. 단백질의 농도는 Coomassie Briallant Blue G(CBBG) 법으로 정량하였다(Bradford, 1976). 등전점(isoelectronic-focusing, IEF) 전기영동은 pH 4-7과 pH 5-8 범위의 17cm immobilized pH gradient gel(IPG) strip(Bio-rad, CA, USA)을 사용하였으며, PROTEIN i12 IEF cell(BioRad, Hercules, CA, USA)에서 실시하였다(Lee et al., 2012). IEF 조건은 rapid ramping mode로 3시간에 걸쳐 10,000V까지 전압을 상승시킨 후 6시간 동안 focusing을 하였다. Sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis(SDS-PAGE)는 11.5%의 SDS-PAGE gel(20×20cm)에 IEF가 종료된 pH 4-7과 pH 5-8의 strip gel을 loading 하여 PROTEIN II xi 2-D cell(BioRad, Hercules, CA, USA)에서 실시하였다. SDS-PAGE의 종료 후 CBBG-250(Bio-rad, CA)을 이용하여 염색하였으며(Matsui et al., 1999), GS-800 Calibrated Densitometer(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)로 scanning 후, PDQuest software(version version 7.2.0, Bio-Rad)를 사용하여 분석하였다. 과피 및 과육의 2-DE 분석은 반복 당 각각 2회씩 독립적으로 추출된 단백질 시료들을 이용하여 6회에 걸쳐 실시되었으며, 고화질의 이미지를 갖는 gel을 선택하여 master gel로 사용하였다. 각각의 단백질 spot들의 발현량(abundance value, AV)은 해당 SDS-PAGE gel의 배경 대비 spot의 상대적인 값으로 측정되었으며, 6회에 걸쳐 실시된 2-DE 이미지 상의 동일 spot들의 평균값으로 비교되었다. 과피 및 과육의 단백질체 분석을 위해 발현되는 각 단백질 spot의 풍부도 값(AV)을 Student 's t-test로 분석하였으며(p < 0.05), 각각에서 2배 이상의 차이가 나는 spot들을 선정하였다.
MALDI-TOF/TOF MS의 분석
MALDI-TOF/TOF MS의 분석을 위해 탈색된 단백질 spot들은 reduction 및 alkylation 처리를 한 후, trypsin으로 in gel digestion을 하였다(Kwon et al., 2016). Trypsin에 의해 분해된 peptide는 extraction solution를 첨가하여 추출한 후 동결·건조시켰다. 단백질의 동정을 위해 sample solution으로 peptide를 용해하고 matrix solution을 첨가하여 섞은 후, MALDI- TOF/TOF MS 분석용 plate에 loading하여 분석을 개시하였다. Peptide의 MS와 MS/MS 분석은 ABI 4800 Plus TOF-TOF Mass Spectrometer(Applied Biosystems, Framingham, MA, USA)로 수행되었다. TOF-TOF MS 분석은 200Hz ND, 355nm YAG laser operation, 25 이상의 signal/noise 비율 및 1kv mode의 1,000–1,250 연속 laser 노출 조건하에서 10개의 higher intense ion들에 대하여 실시되었다. MS와 MS/MS spectra data는 100ppm의 mass tolerance에서 UniProt database(version 20131104; 30 938 908 sequences) 및 Protein Pilot V.3.0 database를 사용하여 분석되었다. Database에서 MS/MS 스펙트럼 검색은 single missing pick, methionine의 oxidation 및 cysteine의 carbamidomethylation의 조건하에서 진행되었다. 각각의 peptide ion score는 p=0.05의 유의수준에서 검색되었다. 동정된 단백질들의 gene ontology(GO) 분석은 TAIR(http://www.arabidopsis.org/), UniProtKB(http://www.uniprot.org/), KEGG(http://www.genome.jp/kegg/) 및 PIR (http://pir.georgetown.edu/) 데이터베이스를 이용하여 수행되었으며, 각각의 단백질들은 GO 분석 결과에 기초하여 각각의 기능 또는 세포 성분의 요소들로 구분되었다.
결과 및 고찰
단백질체의 전개 및 번호의 부여
사과 ‘홍로’의 과육과 과피에서 발현된 단백질체의 양적 차이를 구명하기 위해 정밀하고 재현성이 높은 방법으로 이차원 전기영동을 실시하였다. pI 4-7 및 5-8의 strip gel을 이용하여 각각의 샘플에서 추출된 단백질의 IEF 전기영동을 실시한 후 SDS-PAGE로 전개하였다. pI 범위가 확장된 SDS-PAGE gel의 이미지를 얻기 위하여 pI 4-7의 SDS-PAGE 이미지에서 4–5 영역을 절단한 후 pI 5-8의 SDS-PAGE 이미지에 덧붙여서 pI 4-8의 범위에서 발현된 단백질 spot들의 합성 이미지를 작성하였다. 과피 및 과육에서 발현된 각 spot들의 발현량(abundance value, AV)을 측정하고 Student's t-test로 분석하였으며(p < 0.05), 2배 이상의 차이가 나는 30개의 단백질 spot들을 선정하였다. 선정된 단백질 spot들의 고유 번호는 이전 연구에서와 같이(Kim et al., 2020), 사과의 과피에서 발현된 전체 단백질체에 부여된 고유번호와 동일하였다(Fig. 1).
Fig. 1.
High-resolution 2-DE of total proteins extracted from the peel (A) and flesh (B) of the domestic apple cultivar “Hong-Ro”. A total of 400 µg proteins was separated on IPG strips (17 cm, pH 4–7 and 5–8), followed by SDS-PAGE on 11.5% polyacrylamide gels. The 2-DE Gels were stained with colloidal CBB. The spot numbers represent proteins that were up-regulated by more than two times in the peel or flesh, respectively. The pI 4–5 portion of the pI 4–7 image was cut out and added to the pI 5–8 image to synthesize the overall image of pI 4–8.
과피 및 과육에서 발현량의 차이가 나는 단백질체의 동정
발현량의 차이가 2배 이상인 것으로 선발된 30개의 단백질 spot중 과피에서의 발현량이 과육에 비해 높은 것들은 21, 148, 210, 211, 212, 216, 217, 219, 221, 273, 305, 316, 348, 388, 391, 392, 406, 451, 452, 457, 472, 483, 484, 489 및 495번을 포함하여 합계 25개였으며, 과육에서의 발현량이 과피보다 높은 spot들은 4, 8, 36, 380 및 470번을 포함하여 5개였다(Figs. 1, 2, and Table 1). 선발된 30개의 spot들을 MALDI-TOF/TOF로 분석한 결과 23개의 spot들은 동정되었으나, 과피에서 더 높게 발현된 211, 212, 388 및 495번과 과육에서 더 높게 발현된 4, 36 및 470번의 7개 spot들은 미동정되었다(Table 1).
Table 1.
Analysis of the differentially expressed proteins in the peel and flesh of the domestic apple cultivar “Hong-Ro” by MALDI-TOF/TOF MS
| Spot numberz | Protein name | Abundance valuey | Biological function | |||
| Peel | Flesh | P/F ratio | p valuex | |||
| 4u | unidentified | 7.67 ±0.461) | 16.72 ±3.045) | 1.0 : 2.2 | 0.026 | - |
| 8i |
Chaperonin 60 subunit alpha 1, chloroplastic | 8.28 ±0.780) | 17.34 ±2.801) | 1.0 : 2.1 | 0.014 | Protein folding |
| 21i |
1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase homolog | 0.13 ±0.032) | 0.02 ±0.006) | 6.5 : 1.0 | 0.002 | Ethylene biosynthesis |
| 36u | unidentified | 10.16 ±0.780) | 49.77 ±8.129) | 1.0 : 4.9 | 0.002 | - |
| 148i |
acetyl-CoA acetyltransferase, cytosolic 1 | 2.69 ±0.181) | 0.58 ±0.069) | 4.6 : 1.0 | 0 |
Secondary metabolite biosynthesis |
| 210i |
oxygen-evolving enhancer protein 1, chloroplastic | 1.16 ±0.173) | 0.06 ±0.009) | 19.3 : 1.0 | 0 | Photosynthesis |
| 211u | unidentified | 0.36 ±0.047) | 0.05 ±0.011) | 7.2 : 1.0 | 0 | - |
| 212u | unidentified | 0.30 ±0.038) | 0.02 ±0.004) | 15.0 : 1.0 | 0 | - |
| 216i | (+)-neomenthol dehydrogenase-like | 0.63 (0.069) | 0.15 (0.037) | 4.2 : 1.0 | 0 |
Biological defense and stress response |
| 217i | hypothetical protein OsI_18159 | 3.37 ±0.324) | 0.33 ±0.058) | 10.2 : 1.0 | 0 | Unknown |
| 219i | (+)-neomenthol dehydrogenase-like | 2.13 ±0.409) | 0.03 ±0.004) | 71.0 : 1.0 | 0 |
Biological defense and stress response |
| 221i | L-ascorbate peroxidase 2 | 1.05 ±0.151) | 0.06 ±0.004) | 17.5 : 1.0 | 0 | Antioxidant enzyme |
| 273i |
ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase/oxygenase large subunit | 2.92 ±0.547) | 0.29 ±0.052) | 10.1 : 1.0 | 0.001 | Photosynthesis |
| 305i |
formate dehydrogenase, mitochondrial | 0.55 ±0.092) | 0.09 ±0.023) | 6.1 : 1.0 | 0 |
Biological defense and stress response |
| 316i |
acetyl-CoA acetyltransferase, cytosolic 1-like | 2.67 ±0.251) | 0.33 ±0.065) | 8.1 : 1.0 | 0 |
Secondary metabolite biosynthesis |
| 348i |
8-hydroxygeraniol dehydrogenase-like | 0.69 ±0.066) | 0.05 ±0.011) | 13.8 : 1.0 | 0 |
Secondary metabolite biosynthesis |
| 380i |
NADP-dependent D-sorbitol-6-phosphate dehydrogenase | 0.41 ±0.112) | 1.28 ±0.263) | 1.0 : 3.1 | 0 |
Carbohydrate metabolism |
| 388u | unidentified | 0.24 ±0.070) | 0.01 (0.004) | 24.0 : 1.0 | 0.007 | - |
| 391i | acidic endochitinase SE2-like, partial | 4.21 ±0.288) | 1.62 ±0.331) | 2.6 : 1.0 | 0 |
Biological defense and stress response |
| 392i | acidic endochitinase SE2-like, partial | 1.08 ±0.192) | 0.35 ±0.107) | 3.1 : 1.0 | 0.011 |
Biological defense and stress response |
| 406i | MLP-like protein 34 | 4.89 ±0.594) | 0.61 ±0.132) | 8.0 : 1.0 | 0 | Allergen |
| 451i | major allergen Mal d 1 | 54.42 ±4.586) | 9.69 ±1.269) | 5.6 : 1.0 | 0 | Allergen |
| 452i | major allergen Mal d 1 | 8.80 ±0.544) | 0.49 ±0.071) | 18.0 : 1.0 | 0 | Allergen |
| 457i | major allergen Mal d 1.06A01 | 3.89 ±0.694) | 0.04 ±0.005) | 97.3 : 1.0 | 0 | Allergen |
| 470u | unidentified | 0.78 (0.072) | 3.28 ±0.521) | 1.0 : 4.2 | 0.003 | - |
| 472i | uncharacterized protein At5g02240-like | 1.95 ±0.191) | 0.05 ±0.008) | 39.0 : 1.0 | 0 | Unknown |
| 483i | glutathione S-transferase-like | 1.94 ±0.266) | 0.33 ±0.042) | 5.9 : 1.0 | 0 |
Biological defense and stress response |
| 484i | glutathione S-transferase-like | 1.23 ±0.249) | 0.22 ±0.05) | 5.6 : 1.0 | 0 |
Biological defense and stress response |
| 489i | uncharacterized protein LOC103408523 | 5.34 ±0.444) | 0.08 ±0.014) | 66.8 : 1.0 | 0 | Unknown |
| 495u | unidentified | 2.02 ±0.223) | 0.74 ±0.082) | 2.7 : 1.0 | 0.001 | - |
과피에서 동정된 단백질들 중 spot 21번은 과육보다 발현량이 6.5배 더 높았으며, 1-aminocyclopropane-1-carboxylate (ACC) oxidase homolog로 동정되었다. 일반적으로 에틸렌은 과실의 성숙 과정에서 급격한 방출에 이어 호흡의 피크가 발생하는 climacteric fruits에서 중요한 역할을 하는데, 두 가지 주요 효소인 ACC oxidase 및 ACC synthase에 의해 조절되며 많은 성숙 관련 유전자들의 전사 및 번역에 영향을 미친다(Alexander and Grierson, 2002). 이들 중 ACC oxidase는 S-adenosyl- L-methionine(SAM)으로부터 에틸렌을 합성하는 subpathway의 2번째 단계에 포함되는데, 1-aminocyclopropane-1- carboxylate와 L-ascorbate로부터 에틸렌의 생합성을 촉매한다(Pirrung, 1999). 에틸렌은 사과뿐만 아니라 키위와 같은 climateric fruit에서 직접적으로 과일의 성숙을 촉진하는 효과 외에도 엽록소 분해, carotenoid 및 anthocyanin의 생합성, 전분에서 단당으로의 전환, 향미의 증가 및 세포벽의 연화, 단순당 및 유기산의 축적, 휘발성 물질의 생산 및 과육의 연화 등과 관련된 과일의 생리·생화학 및 유전자 발현에서의 근본적인 대사적 변화를 야기하는 것으로 알려져있다(Palma et al., 2011; Shin et al., 2020). 그러므로 본 실험에서와 같이 수확기 사과 과실의 과육보다 과피에서 높은 비율로 발현된 ACC oxidase homolog는 과피의 엽록소 분해 및 안토시아닌 축적 등 과피색 발현에도 기여할 것이다. Spot 148번 및 316번은 과육보다 과피에서의 발현량이 각각 4.6배 및 8.1배 더 높았으며, acetyl-CoA acetyltransferase, cytosolic 1 및 acetyl-CoA acetyltransferase, cytosolic 1-like로 동정되었다. Acetyl-CoA acetyltransferase, cytosolic 1은 acetyl-CoA로부터 대사 중간체인 (R)-mevalonate를 합성하는 subpathway의 첫 단계에 포함된 효소로, 세포질에서 2분자의 acetyl-CoA로부터 1분자의 acetoacetyl-CoA의 생성을 촉매한다(Meriläinen et al., 2009). Mevalonate는 5탄소 화합물인 isoprene으로부터 유래된 유기물질로 terpene이라고도 하는 isoprene 중합체이며, 대부분 산소 함유 관능기를 가진 다환 구조인 terpenoid의 합성으로 이어진다. 식물 terpenoid는 여러 종류의 terpene, sterol 및 carotenoid 등을 합성하며, 식물 고유의 풍미, 향기, 색깔, 항산화 및 항염증 효과 같은 생리 활성, 세포막의 구성 등 다양한 생리·생화학적 역할을 하는 2차 대사 산물이다(Bohlmann and Keeling, 2008). 따라서 과육보다 과피에서 높게 발현된 acetyl-CoA acetyltransferase 및 그 유사체들은 과피에서 terpenoids의 생합성을 증가시켜 향기와 같은 ‘홍로’ 사과의 풍미와 관련된 생리적 특성을 나타나게 하는데 기여하였을 것이다. Spot 210 및 273번은 과육보다 과피에서의 발현량이 19.3 및 10.1배 더 높았으며, 각각 oxygen-evolving enhancer protein 1, chloroplastic 및 RuBisCO large subunit으로 동정되었다. Oxygen-evolving enhancer protein 1, chloroplastic은 chloroplast photosystem II에서 물을 광분할하는 manganese cluster의 안정화에 관여한다(Yi et al., 2005). RuBisCO는 암반응 과정인 D-ribulose 1,5-bisphosphate의 카르복실화 및 광호흡 과정에서 펜토스 기질의 산화적 단편화를 촉진한다(Izumi et al., 2012). 이와 같이 과육보다 과피에서 광합성 명반응 및 암반응계에 관여하는 단백질의 발현량이 높은 것은 과피에서 엽록체의 존재 비율이 더 높고 광합성이 보다 활발히 일어 나고 있다는 것을 시사하였다. Spot 216번과 219번은 과육보다 과피에서의 발현량이 각각 4.2배와 71.0배 더 높았으며, (+)-neomenthol dehydrogenase-like로 동정되었다. (+)-Neomenthol dehydrogenase는 5개 이상의 탄소를 갖는 포화 및 알파, 베타-불포화 알데히드의 aldehyde carbonyl group의 환원을 촉매하는 aldehyde reductase로, 그 생성물인 neomenthol은 병원균에 대한 항균활성을 갖는 것으로 알려져 있다(Choi et al., 2008). 따라서 과피에서 (+)-neomenthol dehydrogenase 유사체의 높은 발현량은 미생물의 침입을 방지하는 항균활성이 과육보다 과피에서 더 높을 가능성을 시사하였다. Spot 221번은 과육보다 과피에서의 발현량이 17.5배 더 높았으며, hydrogen peroxide catabolic process에 관여하는 L-ascorbate peroxidase 2로 동정되었다. L-ascorbate peroxidase는 heme 함유 peroxidase 계열의 일원으로, 고등 식물의 엽록체 및 시토졸에서 전자공여체로서 L-ascorbate를 사용하여 H2O2를 분해하는 항산화효소의 일종이다(Davletova et al., 2005). 따라서 과피에서는 과육에 비해 H2O2를 분해하는 항산화 능력도 현저히 높을 것으로 예상되었다. Spot 305번은 과육보다 과피에서의 발현량이 6.1배 더 높았으며, formate dehydrogenase(FDH), mitochondrial로 동정되었다. 이 단백질은 많은 식물 종에서, 비 녹색 조직의 미토콘드리아에서는 풍부하나 광합성 조직의 미토콘드리아에서는 비교적 적게 함유되어 있는데 formate로부터 이산화탄소로의 NAD+-의존적 산화반응을 촉매하며, 다양한 stress에 의해서 발현량이 증가한다(Hourton-Cabassa et al., 1998). 또한 methylotrophic yeast 및 bacteria에서 중요하며 메탄올과 같은 유해한 C1 화합물의 이화작용에 필수적인 것으로 알려져 있다(Popov and Lamzin, 1994). 따라서 사과의 과피는 과육에 비해 유해한 C1 화합물의 산화능력이 더 클 것으로 예상되었다. Spot 348번은 과육보다 과피에서의 발현량이 13.8배 더 높았으며, 8-hydroxygeraniol dehydrogenase-like로 동정되었다. 8-Hydroxygeraniol dehydrogenase는 secondary metabolite이며 항암작용이 있는 vinblastine 및 vincristine과 같은 terpenoid indole alkaloid의 전구체인 hydroxygeraniol부터 oxogeranial의 생합성에 관여하는 탈수소 효소이다(Ikeda et al., 1991). 따라서 과피에서 8-hydroxygeraniol dehydrogenase 유사 효소의 발현량이 높은 것으로 보아 teropenoid indole alkaloid 화합물들의 합성도 과육보다 과피에서 더 높을 것으로 사료되었다. Spot 391번과 392번은 과육보다 과피에서의 발현량이 각각 2.6 및 3.1배 더 높았으며, acidic endochitinase SE2-like, partial로 동정되었다. Acidic endochitinase는 fungal pathogen의 구성성분인 키틴에 대한 방어 기능을 담당하는 효소로, 곰팡이의 세포벽 성분인 chitin과 chitodextrin에서 N-acetyl-beta-D-glucosaminide(1->4)-beta-linkage의 무작위적인 endo-hydrolysis를 촉매한다(Yang et al., 2011). 한편 여러 종류의 chitinase는 곰팡이 및 무척추 동물 등의 공격을 방어하기 위해 사과, 바나나, 밤, 키위, 아보카도, 파파야 및 토마토 등과 같은 과일들에 포함되어 있다. 그러나 이들 chitinase 중 일부는 식물 방어에서의 유사한 기능을 하는 알레르기 단백질인 고무 latex의 hevein과 구조가 거의 동일하기 때문에 latex-fruit syndrome으로 알려진 알레르기성 교차 반응을 유발할 수도 있다(Blanco et al., 1999). 따라서 acidic endochitinase 유사체가 더 많이 발현된 과피는 과육에 비해 병원 미생물의 침입시 세포벽의 chitin과 chitodextrin을 가수분해하여 방어 기능을 보다 효율적으로 수행할 수 있지만, 민감한 사람이 섭취시에는 알레르기를 일으킬 수도 있다.
Spot 406, 451, 452 및 457 번은 과육보다 과피에서의 발현량이 각각 8.0배, 5.6배, 18.0배 및 97.3배 더 높았다. Spot 406번은 major latex protein(MLP)-like protein 34, 451번과 452번은 major allergen Mal d 1, 457번은 major allergen Mal d 1.06A01과 같은 알레르기 관련 단백질들로 동정되었다. Spot 406번 MLP-like protein 34는 라텍스 알레르기를 일으키는 단백질의 일종으로 lipid transfer protein(LTP) family에 속한다. 라텍스 알레르기는 천연 고무 라텍스에 존재하는 단백질에 대한 광범위한 알레르기 반응을 의미하며, 라텍스 알레르기가 있는 사람은 라텍스 단백질과 유사한 구조의 단백질들이 포함되어 있는 사과, 멜론, 바나나, 파인애플, 키위, 망고, 딸기와 같은 과일 및 감자, 토마토, 당근, 콩과 같은 각종의 작물 등에도 알레르기 반응을 일으킬 수 있다(Brehler et al., 1997). 여러 가지 작물 중 사과에서 분리된 LTP family 속하는 allergen은 주요 사과 알레르기 유발 단백질 중의 하나인 Mal d 3로(Herndl et al., 2007), 식품 가공시의 열처리나 소화효소들에 의한 변성 및 분해에 저항성이 크고, 위장관에서 감작작용을 일으켜 전신적인 알레르기 증상을 유발하는 경향이 있다(van Ree, 2002). LTP allergen은 인간에 대한 알레르기의 발생외에도 antifungal 및 antibacterial 특성이 있어 식물 방어에서 역할을 담당하며(Salcedo et al., 2004), 왁스와 큐틴과 같은 인지질로 이루어진 세포외 친유성 중합체의 형성에도 참여하는 것으로 알려져 있다(Herndl et al., 2007). LTP allergen은 일반적으로 식물 기관의 외부 표피 층에 축적되는데, 사과의 Mal d 3도 주로 과피에 함유되어 있는 것으로 알려져 있다(Marzban et al., 2005). 따라서 본 실험에서와 같이 과육보다 과피에서 현저하게 높게 발현된 MLP 유사체인 MLP-like protein 34는 감수성인 사람에게 알레르기 증상을 유발하고, 식물 방어 및 과피의 형성을 위한 구성적 요소로써의 역할을 담당할 수도 있을 것으로 예상되었다. 한편 또 다른 알레르기 유발 단백질인 spot 451, 452 및 457번은 Mal d 1 및 그 유사체로 동정되었다. Mal d 1은 17.5 kDa의 분자량을 갖는 자작나무 주요 꽃가루 알레르기 항원인 Bet v 1과 상동성이 있는 주요 사과 알레르기 유발 단백질 중의 하나로 화학적으로 불안정하고 국소적인 알레르기 증상을 유발할 수 있으며(Herndl et al., 2007), Mal d 3와 같이 병원미생물에 대한 방어작용에도 관여 한다(Pühringer et al., 2000). 이전의 보고에 의하면 Mal d 1은 주로 사과 과실의 과육에 포함되어 있는 것으로 알려져 있었으나(Marzban et al., 2005), 본 연구에서는 AV 값 2.0 이상의 발현량을 보이는 Mal d 1 및 그 유사체들이 과육보다 과피에서 현저히 더 높게 발현되는 것으로 나타났다. 이러한 발현량의 차이가 실험에 이용한 사과 품종의 차이 때문인지 또는 단백질의 추출 및 IEF 전기영동 방법상의 차이 때문인지에 대해서는 추가적인 연구가 필요할 것으로 사료된다. 이상의 결과로부터 사과 홍로의 과피는 과육에 비해 MLP-like protein, Mal d 1 및 그 유연체와 같은 병원미생물에 대한 방어작용과 동시에 알레르기를 유발하는 단백질들을 다량으로 함유하고 있는 것으로 나타났으므로, 사과에 대한 알레르기가 다소라도 있는 사람은 ‘홍로’ 사과의 섭취시 과피의 제거에 매우 유의하여야 할 것으로 사료되었다.
Spot 483 및 484번은 과육보다 과피에서의 발현량이 각각 5.9배와 5.6배 더 높았으며, glutathione S-transferase(GST)-like로 동정되었다. GST는 환원형 glutathione을 소수성의 유독한 생체 이물질의 친 전자성 중심에 결합시켜 화합물의 수용성을 높이고 해독시키며, 과산화 지질과 같은 내인성 화합물도 해독한다(Douglas, 1987).또한 GST는 세포내에서 독소에 결합하여 이를 외부로 배출하는 수송단백질로서의 기능도 수행할 수 있다(Leaver and George, 1998). 따라서 ‘홍로’ 사과의 과피에서 다량으로 발현된 GST 유사체들은 사람이 섭취시에 환원형 glutathione을 매개로 하는 해독 활성의 증가에 큰 기여를 할것으로 예상되었다. 한편 spot 217번 hypothetical protein OsI_18159은 과육보다 과피에서의 발현량이 10.2배 더 높았으며, spot 472번 uncharacterized protein At5g02240-like 및 489번 uncharacterized protein LOC103408523은 과육보다 과피에서의 발현량이 각각 39.0배 및 66.8배 더 높았으나, 이들 단백질들의 생물학적 기능은 밝혀지지 않았다. 또한 spot 211, 212, 388 및 495번은 과육보다 과피에서 각각 7.2배, 15.0배, 24배 및 2.7배 더 높게 발현되었으나 동정되지 않았다.
과피보다 과육에서의 발현량이 2배 이상 더 높은 단백질 spot들은 소수에 불과하였다. Spot 8번은 과피보다 과육에서의 발현량이 2.1배 더 높았으며, chaperonin 60 subunit alpha 1, chloroplastic으로 동정되었다. 세포내에서 새로 합성된 단백질은 일반적으로 3차 구조로 접혀야 하는데, chaperonin 단백질들은 이와 같은 새로 합성된 단백질들의 folding에 유리한 조건을 제공하며 응집을 방지한다(Hartl and Hayer-Hartl, 2009). Chaperonin 60 subunit alpha 1, chloroplastic은 RuBisCO small subunit와 large subunit에 결합하여 RuBisCO oligomer의 조립 및 folding에 관여하며, 적절한 엽록체의 발달을 위해 필요한 것으로 알려져 있다(Suzuki et al., 2009). 그러나 과피에서 oxygen-evolving enhancer protein(spot 210번) 및 RuBisCO large subunit(spot 273번)과 같은 엽록체 구성 단백질들의 발현량이 현저히 높았음에도 불구하고 과육에서 chaperonin 60 subunit alpha 1, chloroplastic의 발현량이 더 높은 이유에 대해서는 동 단백질의 아직 밝혀지지 않은 역할을 포함하여 추가적인 연구가 필요하다. Spot 380번은 과피보다 과육에서의 발현량이 3.1배 더 높았으며, NADP-dependent D-sorbitol-6- phosphate dehydrogenase(S6PDH)로 동정되었다. 사과를 비롯한 장미과의 식물들은 중요 광합성 산물로써 솔비톨, 자당 및 전분을 생산하는데, S6PDH는 glucose-6-phosphate로부터 sorbitol-6-phosphate로의 환원을 경유하여 솔비톨을 합성하는데 관여한다(Kanayama et al., 1992). 솔비톨은 주로 사과의 성숙한 잎에서 생합성되며 자당과 함께 체관으로 운반되고, 발달 중인 과일, 종자 및 어린 잎과 같은 수용조직으로 분배되어 과당으로 전환되는 것으로 알려져 있다(Teo et al., 2006). 그러나 본 연구의 결과에서와 같이 사과의 과육과 과피에서도 S6PDH가 발현되며 그 발현 정도가 과육에서 더 높으므로, 포도당으로부터 솔비톨로의 전환이 과육에서 더 높은 비율로 일어날 것으로 예상된다. 또한 이렇게 생합성된 솔비톨은 자당 대비 60%의 감미도를 갖지만 사과의 실질적 당도 증가 요인으로 작용할 수 있다는 가능성을 시사한다(Aprea et al., 2017). 한편 spot 4, 36 및 470번은 과피보다 과육에서 각각 2.2, 4.9 및 4.2배 더 높게 발현되었으나 동정되지 않았다.
사과의 과피는 일반적으로 과육에 비해 농약 등의 화학물질, 강한 일광, 저온 및 고온, 바람과 같은 비생물적 요인이나, 병균이나 해충과 같은 생물적인 요인 등의 불리한 외부 환경에 직접 노출되어 있다. 그러므로 과피에서는 과육에 비해 비생물적 및 생물적 스트레스 상황에 대응하기 위해 생리·생화학적인 작용과 관련된 더 많은 단백질들의 발현을 예상할 수 있다. 사과 ‘홍로’ 품종의 경우에도 과피에서는 과육에 비해 식물호르몬인 ethylene의 생합성(spot 21번), 이차대사산물의 생합성(spot 148, 316 및 348), 광합성(spot 210 및 273), 생체방어 및 스트레스 반응(spot 216, 219, 305, 483, 484, 391 및 392), 항산화효소(spot 221) 및 알레르기(spot 406, 451, 452 및 457) 등과 관련된 다양한 종류의 단백질들이 더 높은 비율로 발현되었다. 이들 단백질들은 불리한 외부환경에 직접적으로 노출된 과피로 하여금 과일의 전체적인 생장과 성숙을 위한 보호 역할을 제공하였을 것으로 예상되었다. 그러나 ‘홍로’의 과피에서 현저히 높은 비율로 발현된 여러 알레르기 관련 단백질의 경우 병원미생물의 침입에 대한 방어작용과 더불어 인간에게 다양한 정도의 알레르기를 유발하는 부작용도 있으므로, 사과 알레르기에 민감한 사람들은 반드시 과피를 제거하고 섭취해야 할 것으로 사료되었다. 과육에서는 과피에 비해 protein folding(spot 8) 및 탄수화물 대사(spot 380)와 관련된 소수의 단백질들만이 더 높은 비율로 발현되었다. 한편 과피에서 기능이 밝혀지지 않았거나(spot 217, 472 및 489) 미동정된(spot 211, 212, 388 및 495) 단백질들이 다수가 있었으며, 과육에서도 미동정된(spot 4, 36 및 470) 단백질들이 존재하였다. 따라서 과피 및 과육에서 특이적으로 작용하는 단백질들의 종류와 그 기능을 보다 정확히 이해하기 위해서는 상기의 발현량의 차이가 나는 단백질 spot들 중 기능이 밝혀지지 않았거나 미동정된 것들을 추가적으로 동정하고 그 기능을 밝힐 필요가 있을 것으로 사료되었다.
